1.4.1. Kỹ thuật hoỏ mụ miễn dịch (HMMD)
Kỹ thuật HMMD đó được ứng dụng rộng rói trờn thế giới. Đõy là bước đột phỏ trong nghiờn cứu bệnh học phõn tử gúp phần định tớnh hoặc bỏn định lượng cỏc phõn tử khỏng nguyờn. Kỹ thuật này là phương phỏp ỏp dụng cỏc nguyờn lý và kỹ thuật miễn dịch để nghiờn cứu tế bào và mụ. Dựa trờn sự biểu lộ mang tớnh đặc hiệu khỏng nguyờn trờn bề mặt tế bào hay tại khu vực gian bào, cỏc khỏng thể đặc hiệu sẽ giỳp cho việc nhận ra và phõn loại cỏc tế bào hay mụ trờn cỏc lỏt cắt tổ chức.
- Cỏc KN cú thể hiện diện ở trong bào tương, màng hoặc nhõn tế bào. KT chủ yếu là IgG. KT kết hợp trực tiếp với KN gọi là KT thứ nhất, cú hai loại:
+ KT đa dũng: chứa nhiều KT khỏc phản ứng với nhiều quyết định KN khỏc. + KT đơn dũng: chỉ chứa một loại quyết định KN. Nhược điểm của loại KT này là cú phản ứng chộo với cỏc quyết định KN tương tự trờn một KN khụng liờn quan.
Vỡ phức hợp KN-KT khụng thể thấy được dưới KHVQH nờn cần một hệ thống để hiển thị vị trớ cú phản ứng KN-KT, gồm hai phần:
- KT thứ hai: là cầu nối KT thứ nhất với hệ thống phúng đại dấu hiệu nhận biết là khỏng KT thứ nhất. KT thứ hai được gắn với Biotin trong phương phỏp ABC.
- Hệ thống phúng đại dấu hiệu nhận biết gồm một men, chất nền và chất màu. Trong phương phỏp ABC, men được gắn với KT bằng một phần cầu nối hoỏ học (Avidin và Biotin). Với một chất nền thớch hợp với men và chất màu được gắn lờn để cho phộp xỏc định sự hiện diện của KN trong mụ dưới KHVQH. Cú nhiều phương phỏp để hiển thị phản ứng KN-KT, song phương phỏp ABC ở trờn được sử dụng nhiều vỡ cú độ nhạy và độ đặc hiệu cao, vỡ Avidin cú ỏi lực mạnh với Biotin và men Peroxidase, làm cầu nối cho men gắn vào Biotin (trờn KT thứ hai). Một phõn tử Avidin cú 4 vị trớ gắn men Peroxidase nờn hệ thống nhận biết được phúng đại lờn gấp 4 lần.
Phương phỏp sử dụng phức hợp avidin – biotin được hầu hết cỏc phũng xột nghiệm hoỏ miễn dịch sử dụng trong nghiờn cứu tế bào và mụ. Với kỹ thuật này, ỏi lực cao của avidin đối với biotin được sử dụng để gắn chất đỏnh dấu peroxidase.
Cỏc bước cơ bản của kỹ thuật miễn dịch enzym Biotin – avidin
Bộ c lộ
Bộ c lộ –– Kết hợp Kết hợp –– K h u yếc h K h uyếch đạiđại
Kh Khááng thể ng thể IIII gắn biotin gắn biotin Kh Khááng thể ng thể II Kh
Khááng nguyng nguyênên Biotin Biotin Avidin Avidin M en M en Bệnh phẩm Bệnh phẩm đđ−−ợc cố ợc cố đđịnh form olịnh form ol
1.4.2. Kỹ thuật sinh học phõn tử [dẫn theo 5]
Kỹ thuật giải trỡnh tự gen trực tiếp: Đõy là phương phỏp thường được sử dụng khi mật độ tế bào ung thư trong mụ phõn tớch ≥ 30%. Với tỷ lệ này, việc cỏc định đột biến gen bằng phương phỏp giải trỡnh tự trực tiếp cú độ nhạy và độ đặc hiệu lờn đến 99%. DNA của bệnh nhõn tỏch chiết từ mẫu mụ được sử dụng để khuếch đại gen EGFR, KRAS và BRAF bằng phản ứng RCR sử dụng cỏc cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được đưa vào giải trỡnh tự trực tiếp sử dụng phương phỏp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA). Trỡnh tự gen được đối chiếu với trỡnh tự của gen EGFR, KRAS, BRAF hoang dại trờn Genbank (National center for
biotechnology information, NCBI) và phõn tớch theo phương phỏp ABI Prism
310 genetic analyzer (Applied Biosystems).
Kỹ thuật PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism)
Phương phỏp phỏt hiện đột biến bằng kỹ thuật PCR-RFLP dựa trờn nguyờn lý: exon 21 của gen EGFR kiểu dại cú vựng trỡnh tự đặc hiệu cho enzyme Mscl, đột biến tại exon 21 gen EGFR làm mất vị trớ cắt của enzyme do đú sản phẩm PCR khụng bị cắt bởi enzyme Mscl. Tương tự, trỡnh tự kiểu dại codon 12 thuộc exon 2 của gen KRAS cú vị trớ nhận biết của enzyme giới hạn BstNI, đột biến tại codon 12 làm mất vị trớ cắt của enzyme BstNI. Với kỹ thuật này thỡ sản phẩm PCR khuếch đại cỏc exon 18-21 gen EGFR và exon 2 gen KRAS được phõn cắt bởi enzyme Mscl hoặc enzyme BstNI. Sản phẩm cắt bằng enzyme được điện di phõn tớch trờn gel agarose NuSieve GTG nồng độ 3% sẽ xỏc định được đột biến điển hỡnh trờn gen EGFR và KRAS. Đõy là phương phỏp truyền thống, đơn giản, rẻ tiền nhưng rất hiệu quả và cho độ tin cậy cao trong trường hợp xỏc định đột biến điển hỡnh. Phương phỏp này hứa hẹn khả năng ỏp dụng rộng rói trong việc sàng lọc nhanh cỏc đột biến tại exon 21 của gen EGFR và đột biến tại codon 12 của gen DRAS một cỏch hiệu quả.
Kỹ thuật Scorpions-Amplification Re-farctory Mutaiton System (Scorpions ARMS).
Hiện nay, nhiều kỹ thuật sinh học phõn tử được ứng dụng nhằm phỏt hiện
đột biết gen EGFR, KRAS, BRAF. Tuy nhiờn chỉ một vài kỹ thuật được cỏc
cơ quan quản lý Y Dược của Chõu Âu và Hoa Kỳ cấp giấy phộp cụng nhận
đạt tiờu chuẩn ứng dụng trong chẩn đoỏn lõm sang. Kỹ thuật Scorpions
ARMS là một trong số ớt những kỹ thuật đú (European Union in vitro
Diagnostic Medical Device Directive 98/79/EC). Scorpions ARMS là sự kết
hợp của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến (ARMS) và cụng nghệ Scorpions trong phản ứng Real time PCR để phỏt hiện cỏc đột biến. Trong đú, nguyờn lý của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến là dựa vào đặc tớnh của Taq DNA polymerase chỉ khếch đại hoàn chỉnh 1 phõn tử DNA một khi đầu 3’ của mồi và sợi khuụn bổ xung hoàn toàn với nhau. Khi đầu 3’ của mồi khụng bổ xung với sợi khuụn phản ứng PCR sẽ bị ức chế hoàn toàn. Dựa trờn nguyờn lý này, kỹ thuật cho phộp khuếch đại đặc hiệu một trỡnh tự đột biến ngay cả trong trường hợp alen đột biến đú chiếm 1 tỷ lệ rất nhỏ trong tổng số sợi khuụn DNA. Scor-pions là phõn tử cú cấu tạo một đầu mang trỡnh tự của đoạn mồi đặc hiệu với alen đột biến cần khuếch đại, đầu trỡnh tự này được nối với một đầu dũ. Fluorophore phỏt tớn hiệu huỳnh quang của đầu dũ được gắn với quencher cú nhiệm vụ dập tắt tớn hiệu huỳnh quang của fluorophore. Trong phản ứng PCR khi đầu dũ bỏm với đoạn trỡnh tự khuếch đại, Fluoro- phore được giải phúng khỏi quencher, phỏt tớn hiệu đến cảm biến của mỏy Realtime-PCR.
Kỹ thuật Smart Amplification Process (SmartAmp).
Kỹ thuật Smart Amplification Process (SmartAmp) là cụng nghệ mới nhất được phỏt triển bởi cỏc nhà khoa học tại viện cụng nghệ RIKEN – Nhật Bản nhằm phỏt hiện cỏc đột biến trờn gen EGFR và KRAS. Nguyờn lý cơ bản
của kỹ thuật SmartAmp là: Khuếch đại DNA = Phỏt hiện đột biến. Để thực hiện được nguyờn lý này kỹ thuật SmartAmp sử dụng: I) cỏc cặp mồi phỏt hiện đột biến được thiết kế bất đối xứng nhằm giảm thiểu cỏc khả năng mồi ghộp cặp sai với sợi khuụn; II) một loại protein mới với khả năng nhận biết và bỏm đặc hiệu tại vị trớ cú sự ghộp cặp khụng tương đồng giữa mồi và khuụn (TaqMutS) ngăn khụng cho phức hợp mồi khuụn được khuếch đại trong phản ứng kộo dài chuỗi. Chỉ những phức hợp mồi – khuụn DNA ghộp cặp hoàn mới được khuếch đại nhờ DNA polymerase, tớn hiệu của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu đột biến được phỏt hiện trong hệ thống mỏy Realtime-PCR. Thực tế cho thấy một trong những khú khăn của việc ỏp dụng cỏc kỹ thuật sinh học phõn tử như giải trỡnh tự, Scorpions ARMS trong thực tế lõm sang thường đũi hỏi qua nhiều bước, đội ngũ kỹ thuật viờn cú kiến thức chuyờn sõu về sinh học phõn tử, giỏ thành cao, thời gian phõn tớch kết quả lõu. Cỏc cụng trỡnh nghiờn ỏp dụng kỹ thuật SmartAmp cho thấy kỹ thuật vận hành qua 1 bước duy nhất “khuếch đại DNA = phỏt hiện đột biến”, cú độ chớnh xỏc cao, thời gian từ khõu tỏch mẫu đến cho kết quả phõn tớch đột biến gen rất ngắn: ∼ 30 phỳt. Đõy là một ưu thế nổi bật của kỹ thuật SmartAmp so với cỏc kỹ thuật khỏc như giải trỡnh tự gen (1-2 ngày), PCR-RFLP (1-2 ngày), Scorpions ARMS (3-4 tiếng). Một khi kỹ thuật SmartAmp được ỏp dụng thành cụng, kỹ thuật mới này sẽ là một cụng cụ đắc lực giỳp cỏc nhà y sinh học và cỏc bỏc sĩ lõm sang Việt Nam hiện thực húa mục tiờu y học: Điều trị bệnh theo thực trạng bộ gen của cỏ thể.
1.5. TèNH HèNH NGHIấN CỨU ĐỘT BIẾN EGFR VÀ ĐIỀU TRỊĐÍCH TRấN THẾ GIỚI ĐÍCH TRấN THẾ GIỚI
Hiện nay cựng với cỏc phương phỏp đang được ỏp dụng trong chẩn đoỏn và điều trị ung thư, cỏc nhà khoa học đó và đang đi sõu vào nghiờn cứu cỏc gen , cỏc marker ung thư đặc hiệu trong đú cú nhúm cỏc protein màng tế bào nhằm gúp phần chẩn đoỏn sớm ở mức độ sinh học phõn tử.
Trờn thế giới đó cú nhiều tỡm hiểu mức độ bộc lộ EGFR trong UTP. Cựng với loại mụ học, giai đoạn bệnh, EGFR cũng được coi là yếu tố tiờn lượng quan trọng.
Theo nhiều nghiờn cứu EGFR thường bộc lộ ưu thế trong UTP khụng tế bào nhỏ, tỷ lệ từ 43-89%. Bộc lộ ưu thế thấy nhiều nhất trong UTBM tế bào vảy: 70%, sau đú là UTBMT: 50% và UTBM tế bào lớn . Ngày càng cú nhiều bằng chứng cho thấy UTBMT tiểu phế quản - phế nang cú tỷ lệ cao EGFR [28]. Cơ chế về hoạt tớnh EGFR trong UTP hiện vẫn chưa được biết . Sự bộc lộ ưu thế cú liờn quan tới tiờn lượng xấu của bệnh [35].
Tỷ lệ EGFR dương tớnh trong UTBMT phổi ở chõu Á là 22 – 67%, ở Bắc Mỹ là 3 -25%, Nam Âu 10 – 24% [21].
Zhiyong và CS 2010 đó khảo sỏt EGFR bằng hoỏ mụ miễn dịch trờn 133 bệnh nhõn UTBMT phổi ở Bệnh viờn Đại học Y khoa Bắc Kinh thấy tỷ lệ EGFR dương tớnh là 68,4% [70].
Quần thể bệnh nhõn sắc tộc Đụng Á carcinom tế bào tuyến nữ giới, chưa bao giờ hỳt thuốc thường cú xu hướng đỏp ứng tốt hơn đối với EGFR-TKI [42, 58]. Trong số những bệnh nhõn đỏp ứng rất tốt với EGFR – TKI, người ta ghi nhận cú đột biến gen EGFR ở hầu hết dõn số này. Bệnh nhõn cú đột biến EGFR cú tỉ lệ đỏp ứng cao hơn (khoảng 60% so với 17%) khi điều trị với EGFR – TKI [66]. Đột biến EGFR thưuờng được ghi nhận ở nữ giới (33,3 – 72% so với 9,3 – 53%) và những người chưa bao giờ hỳt thuốc (25,6% - 71% so với 12,8 – 42%). Ngoài ra, tỉ lệ đột biến được ghi nhận là 30% trong số những bệnh nhõn sắc tộc Đụng Á, nhưng chỉ cú khoảng 8% trong số này cú nguồn gốc từ cỏc sắc tộc khỏc [57]. Do đú, thậm chớ tỉ lệ đột biến EGFR ở nam giới và những người từng hỳt thuốc cao hơn ở vựng Đụng Á so với dõn số thuộc cỏc sắc tộc khỏc.
Paez và cộng sự đó khảo sỏt gen EGFR từ exon 2 đến exon 25 trờn 119 mẫu khối u NSCLC [49]. Phõn tớch trỡnh tự DNA cho thấy cỏc đột biến mất
đoạn và đột biến (missense) ở tổng số 16 mẫu mụ. Tất cả cỏc đột biến được biểu hiện trong cỏc exon 18 – 21 của vựng kinase. Theo cỏc nghiờn cứu trước đú, bệnh nhõn bị đột biến EGFR và cú đỏp ứng tốt với EGFR – TKI cú cỏc đột biến chủ yếu ở exon 18,19 và 21; trong khi những bệnh nhõn bị đột biến exon 20 cú đỏp ứng kộm [62]. Người ta thường ghi nhận cú sự thay thế xảy ra
ở exon 18 và 21, và cú sự mất đoạn ở exon 19 [29]. Đột biến mất đoạn (in
frame) hoặc đột biến thay thế tỏc động đến cỏc acid amin chuyờn biệt; do đú nú cú thể làm thay đổi vị trớ gắn vào vựng tyrosine kinase. Do đú, sự thay thế
này ảnh hưởng đến hiệu quả của EGFR – TKI [49].Hơn nữa, người ta ghi
nhận cú mối liờn quan giữa tỡnh trạng đột biến EGFR và tỉ lệ đỏp ứng với điều trị bằng EGFR – TKI ở bệnh nhõn NSCLC [27],38,6% trong số những bệnh nhõn nghiờn cứu khụng cú đột biến EGFR cú tăng nồng độ EGFR phosphoryl hoỏ trong khi 66,6% bệnh nhõn đột biến EGFR cú tăng EGFR phosphryl hoỏ. Người ta cũng ghi nhận sống cũn khụng cú bệnh tiến triển và sống cũn toàn bộ tốt hơn ở bệnh nhõn NSCLC cú đột biến EGFR [17]. Hiệu quả điều trị cao hơn cũng được ghi nhận ở bệnh nhõn carcinom tế bào tuyến cú đột biến EGFR (85%) so với khụng cú đột biến (khoảng 40%). Tuy nhiờn, trong một nghiờn cứu pha II đơn trung tõm, gefitinib được thiết kế nhằm chứng minh hiệu quả khỏng ung thư trong điều trị đơn trị bước đầu cho những bệnh nhõn NSCLC gia đoạn IIIB/IV chưa được điều tị bằng hoỏ trị trước đú [66]. Cỏc mẫu mụ khối u đượct thu thập để đỏnh giỏ cỏc dấu ấn sinh học. Tỷ lệ đỏp ứng toàn bộ là 50,9%; tuy nhiờn bệnh nhõn cú đột biến mất đoạn ở exon 19 và đột biến L858R ở exon 22 cú tỷ lệ đỏp ứng lần lượt là 95% và 73,9%. Đột biến EGFR thể mất đoạn exon 19 và đột biến L858R ở những bệnh nhõn UTBM tế bào tuyến là yếu tố tiờn lượng tốt nhất cho thấy cú thời gian đến khi điều trị thất bại (TTF) lõu hơn ở bệnh nhõn NSCLC giai đoạn tiến triển chưa được điều trị hoỏ trị sử dụng gefitinib đơn trị bước đầu.
Một nghiờn cứu đột biến EGFR ở bệnh nhõn UTP đó tiến hành ở í. Trong số những người tham gia, cú 53% (454) bệnh nhõn là UTBM tế bào vảy và 4% (31) bệnh nhõn là UTBM tế bào lớn khụng cú đột biến EGFR. Chỉ cú 1/9 BN là UTBMT (34%) cú đột biến EGFR. Tỷ lệ phần trăm đột biến EGFR trong số UTBM phế nang phế quản và UTBM tế bào tuyến thường quy lần lượt là 26% và 6% [37]. Ngoài ra, một nghiờn cứu lõm sàng ở Nhật Bản cho thấy tần suất lưu hành đột biến EGFR cao hơn ở bệnh nhõn nữ so với bệnh nhõn nam (33,33% so với 1,2%) đột biến ở nữ và nam bất kể UTP là tuyến hay khụng) [56]. Tuy nhiờn, trong một nghiờn cứu về tớnh đột biến và hiệu quả của genfitinib ở Nhật Bản, khoảng 56% số bệnh nhõn NSCLC cú đột biến EGFR. Tỷ lệ đột biến cú sự khỏc biệt đỏng kể (p< 0,05) giữa giới, kiểu mụ học và tỡnh trạng hỳt thuốc [41]. Trong một nghiờn cứu được thực hiện tại
Đài Loan, tỉ lệ đột biến EGFR được ghi nhận là 61,1% [17] .Khụng cú sự
khỏc biệt đỏng kể về tỉ lệ đột biến EGFR giữa BN UTBM tế bào tuyến và UTBM khụng phải tế bào tuyến. Tuy nhiờn, thể khụng phải tế bào tuyến cú đột biến EGFR thỡ khụng đỏp ứng với gentifinib. Hơn nữa, trong một nghiờn
cứu đỏnh giỏ hiệu quả ở Đài Loan, tiến hành kiểm tra đột biến EGFR ở 99
mẫu mụ khối u của cỏc BN NSCLC chưa được điều trị trước đú, cú 61,1% đột biến EGFR [66]. Nghiờn cứu IPASS ở chõu Á cho thấy tỷ lệ đột biến EGFR toàn bộ là 59,7% trong số những bệnh nhõn UTBM tế bào tuyến [24]. Trong nghiờn cứu IPASS, tỉ lệ đột biến EGFR cú đặc trưng lõm sàng, bao gồm giới, tuổi, tỡnh trạng hỳt thuốc, tỡnh trạng bệnh. Tỉ lệ phần trăm đột biến EGFR trong số những bệnh nhõn nam và nữ là 49,0% và 63%; trong số những người chưa bao giờ hỳt thuốc và bệnh nhõn trước đú hỳt thuốc là 60,7 % và 46,9%; trong số những bệnh nhõn dưới 65 tuổi và bệnh nhõn từ 65 tuổi trở lờn 56,7% và 68%. Tỉ lệ lưu hành đột biến EGFR ở chõu Á khoảng 60% ở bệnh nhõn NSCLC.
Cỏc nghiờn cứu trước đú đó chứng minh rằng tỡnh trạng đột biến EGFR cú mối tương quan đỏng kể với giới, hỳt thuốc, mụ học và phõn nhúm bệnh lý của UTP [35]. Kể từ khi cỏc nghiờn cứu khỏm phỏ ra rằng bệnh nhõn NSCLC với đột biến EGFR thường cú khuynh hướng đỏp ứng tốt hơn với EGFR- TKI và cú tương quan đến đỏp ứng trờn lõm sàng, vấn đề quan trọng hiện nay là