NGUYấN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2.8.Phương phỏp xỏc định mức độ tiờu thụ oxy của tế bào
Hụ hấp của tế bào vi khuẩn được đỏnh giỏ thụng qua việc đo mức độ tiờu thụ oxy trong mụi trường theo phương phỏp của Caldwell và tập thể [57] sử dụng cỏc tế bào nuụi hiếu khớ để cú tốc độ tiờu thụ oxy cao. Cỏc tế bào nghiờn cứu được nuụi cấy sau đú được rửa 2 lần với dung dịch muối cú chứa KCl 50 mM, MgCl2 1 mM. Cỏc dung dịch tế bào sau đú được bổ sung glucose đến nồng độ cuối cựng là 0,4%,
lắc mạnh trờn mỏy vortex để đạt độ bóo hoà oxy. Mẫu tế bào này được sử dụng để đo lượng oxy tiờu thụ ở nhiệt độ phũng, sử dụng mỏy đo oxy WTW (Đức).
Mức độ oxy cũn lại trong mụi trường được đo sau mỗi phỳt cho đến hết. Đối với thớ nghiệm cú dịch chiết thỡ mẫu tế bào được ủ với dịch chiết nghiờn cứu và đo lượng oxy cũn lại ngay lập tức.
2.2.9. Phương phỏp xỏc định hoạt độ một số enzyme quan trọng của S. mutans
Mẫu để xỏc định hoạt độ enzyme cú thể là dịch chiết tế bào vi khuẩn hay huyền dịch tế bào thấm.
2.2.9.1. Chuẩn bị tế bào thấm
Tế bào vi khuẩn được hoà rửa 1 lần bằng dung dịch muối khoỏng 1x và được hoà lại trong đờm Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 cú bổ sung MgCl2 1 mM sao cho mật độ tế bào (đo bằng mật độ quang học tại bước súng 700 nm) đạt A700 = 14. Dung dịch tế bào này được bổ sung thờm 10% toluene. Hỗn hợp được ủ ở 37 oC trong 5 phỳt, sau đú làm đụng đỏ bằng nitơ lỏng trong 1 phỳt và chuyển trở lại ủ với 37 oC làm tan đú. Bước làm đụng đỏ, làm tan đỏ được lặp lại một lần nữa. Cuối cựng dịch tế bào được ủ ở 37 oC cho tới khi tan đỏ hoàn toàn. Loại bỏ toluene dư bằng ly tõm, phần kết tử được hoà tan lại trong dung dịch muối khoỏng và giữ ở – 80 oC.
Việc bổ sung 10% toluene kết hợp với bước làm sốc nhiệt ở nhiệt độ – 196 oC sau đú làm tan đỏ ngay lập tức ở 37 oC, làm cho màng tế bào vi khuẩn bị tổn thương cục bộ, cho phộp tế bào cú thể thấm được những chất cú khối lượng phõn tử lớn nhưng cỏc enzyme trờn màng và trong tế bào chất khụng bị tổn thương. Vỡ vậy, dịch tế bào được chuẩn bị theo phương phỏp này gọi là dịch tế bào thấm. Dịch tế bào thấm được sử dụng trong một số thớ nghiệm phõn tớch hoạt độ enzyme.
2.2.9.2. Phõn tớch hoạt độ ATPase
ATPase xỳc tỏc cho phản ứng thuỷ phõn ATP tạo ra ADP và phosphat vụ cơ. Hoạt độ ATPase được xỏc định theo phương phỏp được mụ tả bởi Sturr và Marquis [185] thụng qua việc đo lượng phosphate vụ cơ giải phúng ra.
Hỗn hợp phản ứng bao gồm Tris-HCl 100 mM, pH 7, MgCl2 10 mM, dung dịch tế bào thấm, ATP 5 mM. Enzyme được làm bất hoạt bằng axit tricloaxetic 5%. Đối với ống đối chứng, axit được bổ sung trước khi cho cơ chất ATP. Đối với ống
thớ nghiệm hỗn hợp phản ứng được ủ với cơ chất ATP trong 25 phỳt ở 25 oC sau đú mới bổ sung axit để bất hoạt enzyme và làm ngừng phản ứng.
Hỗn hợp sau phản ứng được đem ly tõm ở 10.000 vũng/phỳt trong thời gian 2 phỳt, thu dịch trong trờn tủa. Để định lượng phosphate vụ cơ tạo thành, 150l dịch trong trờn tủa được bổ sung với 900 l thuốc thử Bencini gồm ZnCl2 100 mM, ammonium molibdate 15 mM và 150 l H2O. Hỗn hợp được lắc đều, ủ trong 5 phỳt và đo độ hấp thụ ở bước súng 350 nm. Hiệu số giữa độ hấp thụ của ống thớ nghiệm và ống đối chứng phản ỏnh lượng phosphate vụ cơ tạo thành. Một đơn vị hoạt độ enzyme ATPase là lượng enzyme cần thiết để thủy phõn 1 mol ATP giải phúng ra 1 mol phosphate vụ cơ trong 1 phỳt ở điều kiện phản ứng.
2.2.9.3. Phõn tớch hoạt độ enzyme phosphoryl hoỏđường (PTS)
Hoạt độ của hệ thống enzyme phosphoryl hoỏ đường (PTS) xỏc định theo phương phỏp được mụ tả bởi Belli và Marquis [44]. Enzyme PTS xỳc tỏc cho phản ứng phosphoryl hoỏ glucose thành glucose-6-phosphate với gốc phosphate được lấy từ phospho enolpyruvate (PEP). Sau khi nhường gốc phosphate PEP sẽ chuyển thành pyruvate. Pyruvate sau đú được xỏc định bằng phản ứng với NADH với sự xỳc tỏc của lactate dehydrogenase (LDH).
Hỗn hợp phản ứng gồm Tris-HCl 50 mM, pH 7, MgCl2 20 mM, NaF 1 mM, và glucose 40 mM, dung dịch tế bào thấm, PEP 5 mM. Đối với ống đối chứng, hỗn hợp được ly tõm 10.000 vũng/phỳt trong 2 phỳt để kết tủa tế bào, khụng cho enzyme tiếp xỳc với cơ chất trước khi bổ sung PEP. Đối với ống thớ nghiệm sau khi bổ sung PEP hỗn hợp được ủ ở 37 oC trong 20 phỳt, sau đú ly tõm để dừng phản ứng. Dịch trong trờn tủa được thu lại để định lượng pyruvate.
Để định lượng nồng độ pyruvate 300 l dịch trong trờn tủa được bổ sung với 400 l dung dịch -NADH, 300 l H2O và 2 l LDH. Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ phũng trong 10 phỳt sau đú đem đo độ hấp thụ ở bước súng 340 nm. Hiệu số độ hấp thụ giữa ống đối chứng và ống thớ nghiệm phản ỏnh lượng NADH đó phản ứng với lượng pyruvate tạo thành. Một đơn vị hoạt độ của enzyme phosphoryl hoỏ đường là lượng enzyme xỳc tỏc cho phản ứng phosphoryl hoỏ 1 mol glucose thành 1 mol
glucose-6-phosphat, tương đương với 1 mol NADH bị oxi hoỏ thành NAD+ trong phản ứng chuyển hoỏ pyruvate thành lactate trong 1 phỳt ở điều kiện phản ứng.
2.2.9.4. Phõn tớch hoạt độ NADH oxidase
Hoạt độ của NADH oxidase được xỏc định theo phương phỏp của Poole và Claiborne [154]. Phản ứng dựa trờn sự oxi hoỏ NADH bởi NADH oxidase. Hỗn hợp phản ứng bao gồm:
a) 500 l đệm phosphate 200 mM, EDTA 1,2 mM, pH 7,0 b) 200 l tế bào thấm
c) 100 l -NADH 2 mM
Đối với ống kiểm tra, hỗn hợp cỏc dung dịch a, b được trộn đều và ly tõm ở 4 oC, 10.000 vũng/phỳt trong 2 phỳt, sau đú được bổ sung dung dịch c. Đối với ống thớ nghiệm, hỗn hợp cỏc dung dịch a, b, được trộn đều, sau đú được bổ sung dung dịch c và trộn đều ngay lập tức. Đo độ hấp thụ ở bước súng 340 nm trong vũng 3 phỳt. Hiệu số độ hấp thụ giữa ống kiểm tra và ống thớ nghiệm phản ỏnh lượng NADH đó phản ứng. Một đơn vị hoạt độ của NADH oxidase là lượng enzyme xỳc tỏc cho phản ứng chuyển hoỏ 1 mol NADH thành NAD+ trong 1 phỳt ở điều kiện phản ứng.
2.2.9.5. Phõn tớch hoạt độ lactate dehydrogenase
Lactate dehydrogenase xỳc tỏc cho phản ứng chuyển hoỏ pyruvate thành lactate. Hoạt độ của enzyme này được xỏc định theo phương phỏp của Iwami và tập thể [106]. Hỗn hợp phản ứng bao gồm:
a) 500 l đệm Tris-HCl 100 mM, NaCl 100 mM, FBP 2 mM, pH 7,0 b) 100 l -NADH 2 mM
c) 200 l H2O
d) 200 l tế bào thấm
e) 100 l dung dịch natri pyruvate 300 mM
Đối với ống kiểm tra, hỗn hợp cỏc dung dịch a, b, c, d được trộn đều, được ly tõm ở 4 oC, 10.000 vũng/phỳt trong 2 phỳt, sau đú được bổ sung dung dịch e. Đối với ống thớ nghiệm, hỗn hợp cỏc dung dịch a, b, c, d, được trộn đều, sau đú được bổ
sung dung dịch e và trộn đều và ngay lập tức đo sự thay đổi độ hấp thụ ở bước súng 340 nm trong vũng 3 phỳt. Hiệu số độ hấp thụ giữa ống kiểm tra và ống thớ nghiệm phản ỏnh lượng NADH đó phản ứng. Một đơn vị hoạt động của lactate dehydrogenase là lượng enzyme xỳc tỏc cho phản ứng chuyển hoỏ 1mol pyruvate thành lactate tương đương với 1mol NADH bị oxi hoỏ thành NAD+ trong 1 phỳt ở điều kiện phản ứng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.9.6. Phõn tớch hoạt độ pyruvate kinase
Pyruvate kinase xỳc tỏc cho phản ứng chuyển hoỏ PEP thành pyruvate khi cú mặt của ADP. Hỗn hợp phản ứng bao gồm:
a) 500 l Tris-HCl 100 mM, KCl 200 mM, MgCl2 20 mM, EDTA 1 mM b) 100 l ADP 100 mM
c) 100 l PEP 100 mM d) 200 l tế bào thấm e) 200 l H2O
Đối với ống kiểm tra, hỗn hợp cỏc dung dịch a, b, d, e được trộn đều và ly tõm ở 4 oC, 10.000 vũng/phỳt trong 2 phỳt. Sau đú hỗn hợp, được bổ sung dung dịch c và ly tõm thờm một lần nữa, dịch trờn tủa được thu vào ống nghiệm sạch. Đối với ống thớ nghiệm, hỗn hợp cỏc dung dịch a, b, d, e được trộn đều, sau đú được bổ sung dung dịch c trộn đều và giữ hỗn hợp phản ứng trong vũng 10 phỳt ở nhiệt độ phũng, ly tõm và thu dịch trờn tủa như ống kiểm tra.
Phương phỏp định lượng pyruvate: Hỗn hợp phản ứng gồm 400 l dịch trờn tủa, 100 l dung dịch -NADH 2 mM và 500 l dung dịch Tris-HCl 100 mM, được trộn đều và được bổ sung 2 l enzyme lactate dehydrogenase. Đo độ hấp thụ ở bước súng 340 nm. Hiệu số độ hấp thụ giữa ống kiểm tra và ống thớ nghiệm phản ỏnh lượng NADH đó phản ứng với lượng pyruvate tạo thành.
Một đơn vị hoạt động của pyruvate kinase là lượng enzyme xỳc tỏc cho phản ứng chuyển hoỏ 1mol PEP thành pyruvate tương đương với 1mol NADH bị oxy hoỏ thành NAD+ trong phản ứng chuyển hoỏ pyruvate thành lactate trong 1 phỳt ở điều kiện phản ứng.
Trong tất cả cỏc phõn tớch ảnh hưởng của dịch chiết hay hợp chất thực vật thứ cấp lờn hoạt độ của enzyme thỡ phần thể tớch dịch chiết hay hợp chất được bổ sung vào ủ với enzyme tương ứng trong 10 phỳt, trước khi bổ sung cơ chất để bắt đầu phản ứng. Mức độ ảnh hưởng của dịch chiết hay hợp chất được đỏnh giỏ bằng việc so sỏnh hoạt độ enzyme cũn lại khi cú dịch chiết hay hợp chất so với hoạt độ enzyme khi khụng cú dịch chiết hay hợp chất cần khảo sỏt.