NGUYấN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2.3. Phương phỏp nhận dạng vi khuẩn Streptococcus mutans phõn lập từ mẫu bệnh nhõn sõu răng người Việt Nam
bệnh nhõn sõu răng người Việt Nam
2.2.3.1. Kiểm tra hỡnh thỏi vi khuẩn
Kiểm tra hỡnh thỏi tế bào được tiến hành bằng phương phỏp chụp ảnh hiển vi điện tử, dưới kớnh hiển vi JSWLV-5410 (Nhật Bản) ở cỏc độ phúng đại khỏc nhau với sự giỳp đỡ của Viện 69 (Bộ Tư lệnh Bảo vệ Lăng Hồ Chớ Minh).
2.2.3.2. Phương phỏp nhuộm Gram cải tiến
Phương phỏp nhuộm Gram tiến hành theo phương phỏp được mụ tả bởi của Vũ Thị Minh Đức và tập thể [6]. Cỏc bước chớnh phương phỏp bao gồm: làm vết bụi tiờu bản được tạo ra từ cỏc khuẩn lạc đơn sau đú được nhuộm với dung dịch lugol (KI và I2) trong thời gian 30 giõy đến 1 phỳt. Dung dịch ethanol 95% cú chứa iốt được sử dụng trong việc tảy màu tiờu bản.
Hỡnh thỏi khuẩn lạc được quan sỏt và chụp ảnh dưới kớnh hiển vi quang học Olympus (Nhật Bản) với độ phúng đại 100 lần. Vi khuẩn Gram (+) cú màu xanh- tớm, vi khuẩn Gram (-) cú màu hồng.
2.2.3.3. Kiểm tra hoạt tớnh catalase
Để tiến hành kiểm tra hoạt tớnh catalase của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập được, dung dịch hydro peroxide 3% được nhỏ trực tiếp lờn bề mặt khuẩn lạc hoặc lấy một ớt sinh khối tế bào đặt lờn phiến kớnh sạch. Quan sỏt hiện tượng bằng mắt thường hoặc dưới kớnh hiển vi, phản ứng được coi là dương tớnh (cú hoạt tớnh catalase) nếu bọt khớ xuất hiện và ngược lại là õm tớnh khi khụng quan sỏt thấy bọt khớ xuất hiện [6].
2.2.3.4. Kiểm tra bằng cỏc phản ứng hoỏ sinh (Kit API 20 Strep)
Cỏc chủng vi khuẩn được nuụi cấy lắc trong mụi trường TYG qua đờm ở 37 oC sau đú được cấy gạt trờn mụi trường thạch TSA, ủ ở 37 oC trong 48 giờ. Cỏc khuẩn lạc trờn đĩa thạch được thu lại và hũa tan vào 2 ml nước cất khử trựng tạo thành dịch vi khuẩn. Dịch vi khuẩn này sau đú phải được sử dụng ngay.
Để kiểm tra hoạt tớnh cỏc enzyme, 10 phản ứng đầu của dóy thử API được tiến hành bằng cỏch bổ sung 100 l dịch vi khuẩn chuẩn bị ở trờn cho từng phản ứng. Đối với việc kiểm tra khả năng lờn men đường của cỏc chủng vi khuẩn, dung dịch tế bào vi khuẩn được trộn đều vào mụi trường API GP (do nhà sản xuất cung cấp), sau đú đổ đầy cỏc ống trong dóy thử (khoảng 120 l dịch). Dầu khoỏng được nhỏ lờn phớa trờn cỏc ống để tạo nờn điều kiện kị khớ. Cỏc ống được ủ ở nhiệt độ 37 oC trong thời gian từ 4 đến 4,5 giờ để đọc kết quả lần thứ nhất và sau 24 giờ để kiểm tra kết quả lại lần 2.
Kiểm tra hoạt động enzyme bằng sự thay đổi màu sắc của hỗn dịch phản ứng khi bổ sung thuốc thử. Kiểm tra khả năng chuyển húa đường được phỏt hiện nhờ sự thay đổi màu của hỗn dịch phản ứng (dựa vào pH được tạo ra). Xử lý kết quả thu được xử lý theo phần mềm API 20Strep.
2.2.3.5. Phương phỏp PCR nhõn bản đoạn gen mó húa cho ARN ribosome 16S và
kỹ thuật đa hỡnh độ dài cỏc đoạn giới hạn
ADN của hệ gen vi khuẩn được tinh sạch theo phương mụ tả bởi Sambrook và Rusell [171], hàm lượng ADN được xỏc định bằng cỏch đo độ hấp thụ ỏnh sỏng ở bước súng 260 nm (A260). Cỏc mẫu ADN được kiểm tra bằng điện di trờn gel agarose 1%, gel sau đú được nhuộm bằng ethidium bromide và được soi dưới đốn tử ngoại và chụp ảnh.
Cặp mồi sử dụng cho việc nhõn bản gen mó hoỏ ARN ribosome 16S bao gồm mồi xuụi 8UA: 5’- AGA GTT GAT CCT GGT CAG -3’ và mồi ngược 1492R: 5’- TAC GGG TAC CTT GTT ACG ACT T-3’. Một phản ứng PCR (25 l) bao gồm 100 ng ADN khuụn, 2,5 l đệm 10x Taq polymerase, 25 mM dNTP, 50 ng mỗi loại mồi xuụi và mồi ngược, 0,5 đơn vị Taq polymerase, H2O vụ trựng vừa đủ đến 25 l.
Hỗn hợp được trộn đều, chuyển vào mỏy PCR và tiến hành chạy với chu trỡnh nhiệt: 94 oC trong 7 phỳt để làm biến tớnh hoàn toàn ADN khuụn thành hai sợi đơn, tiếp theo là 35 chu kỡ phản ứng lặp lại gồm 3 bước: 94 oC trong 1 phỳt để biến tớnh ADN, 60 oC trong 1 phỳt để gắn mồi và 72 oC trong 1,5 phỳt để kộo dài chuỗi,
sau đú đến thời gian ủ ở 72 oC trong 7 phỳt và giữ mẫu ở 4 oC đến khi phõn tớch. Điện di kiểm tra sản phẩm trờn gel agarose 1%.
Sản phẩm PCR sau khi được nhõn lờn, tinh sạch theo Kit của hóng Bioneer (Hàn Quốc), sản phẩm sau tinh sạch được điện di kiểm tra trờn gel agarose 1%. Sản phẩm gen ARNr 16S tinh sạch được xử lý với 2 enzyme giới hạn HpaII và HaeIII với thành phần phản ứng như sau: 3 l đệm, 3 l enzyme, 10 l khuụn, H2O vụ trựng vừa đủ 30 l. Phản ứng được ủ ở 37 oC từ 4 đến 16 giờ, điện di kiểm tra trờn gel agarose 2%.
2.2.3.6. Phương phỏp PCR mồi đặc hiệu nhõn bản đoạn gen mó húa cho dextranase của Streptococcus mutans
Đoạn gen mó húa cho dextranase của S. mutans được nhõn bản bằng phản
ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SD1 và SD2 với trỡnh tương ứng theo chiều 5’-3’ TAT GCT GCT ATT GGA GGT TC và AAG GTT GAG CAA TTG AAT CG.
Một phản ứng PCR (25 l) cho việc nhõn bản gen mó hoỏ dextranase của S. mutans bao gồm 100 ng ADN khuụn, 2,5 l đệm 10x Taq polymerase, 0,4 l dNTP (25 mM), 50 ng mỗi loại mồi xuụi và mồi ngược, 0,5 đơn vị Taq polymerase, H2O vụ trựng vừa đủ 25 l. Hỗn hợp được trộn đều, chuyển vào mỏy PCR và tiến hành chạy với chế độ nhiệt: 94 oC trong 7 phỳt để làm biến tớnh hoàn toàn ADN khuụn, tiếp theo là 35 chu kỡ phản ứng lặp lại gồm 3 bước: 94 oC trong 1 phỳt để biến tớnh ADN, 58 oC trong 1 phỳt để gắn mồi và 72 oC trong 1 phỳt để kộo dài chuỗi, sau đú đến thời gian ủ ở 72 oC trong 5 phỳt và mẫu được giữ ở 4 oC đến khi phõn tớch. Sản phẩm thu được được điện di kiểm tra trờn gel agarose 1%.
2.2.3.7. Phương phỏp đọc trỡnh tự gen đoạn mó hoỏ ARNr 16S
Sản phẩm PCR đoạn gen mó húa cho ARNr 16S được pha loóng ở nồng độ thớch hợp (khoảng 50-100 pmol) để dựng cho việc xỏc định trỡnh tự. Phản ứng PCR cho xỏc định trỡnh tự đoạn gen mó hoỏ ARNr 16S cú thành phần gồm: 6 l hỗn hợp DTCS Master mix, 1 l khuụn, 1 l mồi (8UA hoặc 1492R), H2O vụ trựng vừa đủ 20 l. Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trỡnh nhiệt: 96 oC trong 1 phỳt để khởi động núng, tiếp theo là 35 chu kỳ gồm 3 bước: 96 oC trong 30 giõy để làm biến
tớnh ADN, 60 oC trong 30 giõy để gắn mồi và 60 oC trong 4 phỳt để kộo dài chuỗi. Mẫu sau đú được ủ tiếp ở 60 oC trong 7 phỳt và giữ ở 4 oC cho đến khi phõn tớch.
Sản phẩm của phản ứng PCR này sẽ tiếp tục được xử lý trước khi đưa vào mỏy đọc trỡnh tự thực hiện theo cỏc bước yờu cầu của hóng sản xuất. Giải trỡnh tự bằng mỏy đọc trỡnh tự ABI 3100 của hóng Perkin-Elmer (Mỹ).