KẾT QUẢ NGHIấN CỨU
3.2.2.Tỏch chiết tinh sạch một số chất thứ cấp từ cõy Sao đen
Để tỏch, tinh sạch một số chất thứ cấp từ vỏ Sao đen chỳng tụi đó chiết cỏc chất ra khỏi mẫu bằng cỏch ngõm mẫu (bột) trong ethanol (tỷ lệ 1 g mẫu: 10 ml dung mụi) trong thời gian 5 ngày (hỡnh 3.12). Dịch chiết sau đú được cụ lại để loại bỏ bớt dung mụi. Dịch chiết sau khi cụ đặc lại sau khi loại bỏ ethanol dư được chiết tiếp bằng cỏc dung mụi khỏc nhau với độ phõn cực tăng dần cụ thể là n-hexan, chloroform, ethyl acetate và n-butanol. Dung mụi trong cỏc phõn đoạn dịch chiết này được làm bay hơi để thu phõn đoạn cỏc chất chiết ra. Từ 0,5 kg vỏ Sao đen nguyờn liệu ban đầu chỳng tụi đó thu được 2 g hỗn hợp với phõn đoạn chiết bằng n- hexan, 6,5 g hỗn hợp với phõn đoạn chiết bằng choloroform, 3 g hỗn hợp chiết bằng ethyl acetate và 4 g hỗn hợp chiết bằng n-butanol. Như vậy cú thể thấy rằng chloroform cú hiệu suất chiết cao nhất. Khi thử nghiệm ảnh hưởng của cỏc phõn đoạn này lờn khả năng sinh axit của S. mutans GS-5, chỳng tụi thấy rằng phõn đoạn chiết bằng chloroform cũng thể hiện khả năng ức chế sự sinh axit của S. mutans GS- 5 tốt hơn cỏc phõn đoạn cũn lại (kết quả khụng trỡnh bày ở đõy), chớnh vỡ vậy phõn đoạn này được lựa chọn để cho cỏc bước tinh sạch tiếp theo.
Phõn đoạn dịch chiết bằng chloroform của vỏ Sao đen được cho qua cột silicagel cho rửa chiết bằng hệ dung mụi methanol: nước (MeOH: H2O) với tỷ lệ methanol tăng dần (tức là sự phõn cực tăng dần) chỳng tụi thư được 6 phõn đoạn hợp chất khỏc nhau ký hiệu lần lượt là S1, S2, S3, S4, S5 và S6 qua bước sắc ký này. Phõn đoạn S6 thu được cú khối lượng lớn nhất và cú hoạt tớnh ức chế sinh axit tốt nờn được tiếp tục sắc ký qua cột sắc ký pha đảo RP-18 rửa chiết bằng hệ dung mụi methanol: acetone: nước theo tỷ lệ 2:1:2 về thể tớch. Kết quả chỳng tụi đó tỏch, thu được 2 hợp chất được ký hiệu là SDE1 và SDE2.
Hợp chất SDE1 cú nhiệt độ núng chảy 350-351oC. Phổ 13C-NMR của hợp chất SDE1 xuất hiện tớn hiện của 28 cacbon, trong đú cú bốn vạch C-H chập vào nhau được xỏc định bằng phổ 1H-NMR và phổ DEPT khẳng định thờm sự tồn tại của hai vũng benzen thế para. Kết quả phõn tớch phổ được nờu ra cụ thể trờn bảng 3.7. Những dữ kiện phổ cộng hưởng từ hạt nhõn cho thấy hợp chất SDE1 cú cấu trỳc kiểu oligostilben, một cấu trỳc rất đặc trưng của cỏc hợp chất thuộc chi Hopea
[188]. Trờn cơ sở ngõn hàng dữ liệu đó cụng bố, cỏc dữ kiện phổ của hợp chất SDE1 phự hợp với cấu trỳc của hợp chất hopea phenol, hợp chất duy nhất đó được phõn lập từ Hopea odorata. Hợp chất này cú tớnh đối xứng bậc hai và cú cụng thức phõn tử C56H42O12 (hỡnh 3.13). Cỏc tương tỏc H-C được phõn tớch và mụ tả trờn hỡnh 3.14.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn của chất SDE2 cú dạng tương tự như phổ cộng hưởng từ hạt nhõn của SDE1. Cỏc dữ kiện phổ NMR của SDE2 được so sỏnh trực tiếp với cỏc dữ kiện phổ tương ứng của hợp chất malibatol A đo trong cựng dung mụi và cho kết quả hoàn toàn phự hợp (Bảng 3.7), tương ứng với cụng thức phõn tử C28H20O7 (hỡnh 3.13) của malibatol A một hợp chất thuộc nhúm polyphenol đó được biết đến từ loài Hopea malibato cú hoạt tớnh gõy độc tế bào cao với giỏ trị IC50 = 21
Dịch chiết n- hecxan Dịch chiết n- butanol Bột vỏ Sao đen Chiết ngõm bằng ethanol Cất loại bỏ dung mụi Dịch chiết ethanol cụ
đặc
Cột pha đảo RP-18 với hệ dung mụi MeOH/ acetone /H2O (2/1/2)
Sắc ký cột silicagel gradient hệ dung mụi MeOH: H2O theo độ phõncực tăng dần
Chiết lần lượt với n-hecxan, chloroform3, ethyl acetate, n- butanol độ phõn cực tăng dần
Dịch chiết chloroform
Dịch chiết ethyl acetate
Cất loại bỏ dung mụi
Dịch chiết chloroform Gộp cỏc phõn đoạn cú sắc ký đồ Rf tương đương nhau Chất SDE 2 Malibatol A Thu 6 phõn đoạn Chất SDE 1 Hopea phenol
g/ml ức chế sự phỏt triển của dũng tế bào CEM-SS [70]. Tuy nhiờn đõy là cụng trỡnh đầu tiờn phỏt hiện sự cú mặt của malibatol A ở loài Hopea odorata.
HO O HO H H HO OH OH OH HO O HO OH H H OH HO H 1a 2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a 10a 11a 12a 13a 14a 1b 2b 3b 4b 5b 6b 7b 8b 9b 10b 11b 12b 13b 14b 1b' 2b' 3b' 4b' 5b' 6b' 7b' 8b' 9b'10b' 11b' 12b' 13b' 14b' 1a' 2a' 3a' 4a' 5a' 6a' 7a' 8a' 9a' 10a' 11a' 12a' 13a' 14a'