C a,d ST3A axit asiatic
4.4.Phõn lập nhận dạng chủng S.mutans từ bệnh nhõn sõu răng ở Việt Nam
S.sp H2S mutans DQ46
4.4.Phõn lập nhận dạng chủng S.mutans từ bệnh nhõn sõu răng ở Việt Nam
Nghiờn cứu chủ yếu của chỳng tụi được tiến hành với chủng S. mutans GS-5, là chủng được rất nhiều phũng thớ nghiệm quốc tế khỏc sử dụng cho nghiờn cứu. Bờn cạnh S. mutans GS-5, một số chủng khỏc thuộc loài này cũng được nhiều nhà nghiờn cứu sử dụng như S. mutans UA-159, S. mutans 6715, S. mutans LM-7, S. mutans OMZ-175, S. mutans OMZ-65, S. mutans NCTC-10449T, S. mutans NCIB-
11723, S. mutans MT-8148 v.v... Cỏc chủng này đều đó được nghiờn cứu kỹ về mặt sinh lý, húa sinh, thậm chớ hệ gen đầy đủ của S. mutans UA-159 đó được cụng bố năm 2002 với khoảng trờn 20.000 bp [43]. Tại Việt Nam, cũng bắt đầu cú một số nghiờn cứu quan tõm đến thành phần vi khuẩn mảng bỏm răng, thành phần vi khuẩn dịch lợi và mảng bỏm dịch lợi của người Việt Nam [22, 36]. Tuy vậy, cõu hỏi chưa được trả lời là liệu người Việt Nam, với chế độ dinh dưỡng và cỏch thức chế biến thức ăn khỏc so với cỏc nước trờn thế giới thỡ cỏc chủng S. mutans gõy sõu răng ở người Việt Nam cú những đặc điểm nào giống và khỏc với cỏc chủng chuẩn đó cụng bố? Để gúp phần trả lời cõu hỏi này, chỳng tụi đó là tỏc giả đầu tiờn thực hịờn việc phõn lập, nhận dạng và xỏc định một số đặc trưng của một số chủng S. mutans cú trong mảng bỏm răng của người Việt Nam.
S. mutans được phỏt hiện ở tất cả cỏc mảng bỏm răng và cú số lượng rất cao
ở những vựng sõu răng. Vỡ vậy chỳng tụi cũng bắt đầu việc phõn lập từ mẫu mảng bỏm răng của bệnh nhõn sõu răng (Khoa Răng Hàm Mặt, Bệnh viện Bạch Mai).
Mụi trường Mitis salivarius được xem là cú tớnh chọn lọc cho Streptococcus vỡ vậy được lựa chọn cho bước đầu tiờn để hạn chế tối đa những loài khụng thuộc chi này thậm chớ với mụi trường này cũng cú thể giỳp việc nhận dạng hai chủng vi khuẩn gõy sõu răng cú nhiều đặc điểm giống nhau là S. mutans và S. sobrinus. S. mutans cú thể sống và sinh trưởng ở pH axit, thậm chớ là dưới 3, ở độ axit này hầu
việc phõn lập nhanh cỏc S. mutans. Thực tế khi phối hợp sử dụng hai mụi trường mitis salivarius và mụi trường TSA pH 5 cho việc phõn lập, đối chiếu với những đặc về thời gian sinh trưởng, hỡnh thỏi và màu sắc khuẩn lạc với S. mutans GS-5
chuẩn chỳng tụi đó lựa chọn được 6 chủng vi khuẩn thuộc chi Streptococcus. Cỏc chủng vi khuẩn này qua cỏc kết quả chụp ảnh hiển vi điện tử kết hợp với nhuộm gram, hoạt tớnh catalase đều khẳng định thờm chỳng thuộc nhúm Streptococcus.
Kit thử hoỏ sinh API 20 Strep của hóng BioMerieux (Phỏp) được thiết kế riờng cho việc nhận dạng cỏc chủng vi khuẩn thuộc nhúm Streptococcus và Enterococcus. Việc sử dụng kit thử này cú ưu điểm là thời gian nhanh chúng (4 đến 24 giờ), phản ứng xảy ra nhờ đặc tớnh lờn men cỏc nhúm đường cũng như hoạt tớnh của cỏc enzyme đặc trưng của nhúm Streptococcus và cuối cựng ưu điểm của kit API 20 strep là cỏc kết quả được mó hoỏ nờn cú thể so sỏnh với ngõn hàng dữ liệu để xỏc định tờn vi khuẩn tới mức độ loài. Nhiều tỏc giả trờn thế giới đó so sỏnh kết quả của việc sử dụng kit thử API 20 strep với cỏc phương phỏp chớnh ở mức độ phõn tử và cho kết quả tương đương. Kết quả nhận dạng bằng kit API 20 Strep với 6 chủng phõn lập từ người Việt Nam của chỳng tụi bước đầu cho thấy chỳng đều thuộc chi Streptococcus. Trong số 6 chủng này, hai chủng ký hiệu là H2 và H3 lại cú khả năng sinh axit mạnh và chịu axit tốt, do vậy chỳng tụi ỏp dụng cỏc kỹ thuật sinh học phõn tử PCR-RFLP để tiếp tục phõn loại xỏc định tờn cỏc chủng vi khuẩn này. Theo Sato và tập thể [173,174], phương phỏp PCR-RFLP trờn đoạn gen mó húa cho ARNr 16S khụng những cú thể phõn biệt cỏc loài trong nhúm mutans streptococci mà cũn cú thể nhận dạng cỏc chủng được phõn lập cú thuộc loài S. mutans hay khụng, vỡ vậy chỳng tụi đó thực hiện kỹ thuật RFLP trờn cỏc đoạn gen
mó húa cho ARNr 16S của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập được, kết hợp với kỹ thụõt PCR nhõn bản đoạn gen mó hoỏ cho dextranase đặc trưng cho Streptococcus
mutans. Kết quả phõn tớch bằng PCR-RFLP và PCR đó khẳng định cỏc chủng vi
khuẩn H1, H2 và H3 phõn lập được từ bệnh nhõn Việt Nam là thuộc loài
Streptococcus mutans.
Cỏc chủng S. mutans phõn lập được trong nghiờn cứu của chỳng tụi cũng cú những đặc tớnh khỏc so với S. mutans GS-5 chuẩn, cụ thể khả năng sinh axit, chịu axit thỡ cỏc chủng phõn lập được đều tỏ ra vượt trội hơn chủng S. mutans GS-5. Một
đặc điểm rất đỏng chỳ ý khỏc khi so sỏnh về đặc điểm hoỏ sinh chỳng tụi cũng nhận thấy là chủng S. mutans GS-5 cú khả năng chuyển hoỏ hầu hết cỏc loại đường trong kit API 20 Strep thỡ S. mutans H2 lại khụng cú khụng cú khả năng chuyển hoỏ
đường như L-arabinose, D-mannitol, D-sobitol, Inulin, amidon.
Cỏc kết quả nghiờn cứu phõn lập nhận dạng S. mutans phõn lập từ người Việt nam chứng tỏ ngoài những điểm tương đồng với chủng S. mutans GS-5, cỏc chủng
S. mutans phõn lập từ bệnh nhõn sõu răng ở Việt Nam tỏ ra cú những khỏc biệt nhất
định so với chủng quốc tế hiện đang được sử dụng. Cở sở phõn tử của những khỏc biệt này là gỡ và sự liờn quan của chỳng đối với những đặc trưng dịch tễ hay khả năng gõy bệnh sõu răng là vấn đề cần được tiếp tục nghiờn cứu.
Túm lại, cỏc kết quả nghiờn cứu thu được trong nghiờn cứu của chỳng tụi đó cung cấp nhiều dẫn liệu về khả năng khỏng khuẩn sõu răng của một số loại dịch chiết thực vật cú ở Việt Nam, đặc biệt là vỏ Sao đen, lỏ Sắn thuyền. Nghiờn cứu cũng đưa ra phương phỏp tỏch, tinh sạch 2 hợp chất thực vật thứ cấp (hopea phenol và malibatol A) từ vỏ Sao đen và một hợp chất (axit asiatic từ lỏ Sắn thuyền) và tỡm hiểu một cỏch khỏ đầy đủ, chi tiết về tỏc dụng của 3 hợp chất thực vật thứ cấp này lờn cỏc quỏ trỡnh sinh lý, hoỏ sinh, hệ enzyme và cỏc enzyme liờn quan trực tiếp đến đặc trưng gõy sõu răng của vi khuẩn gõy sõu răng S. mutans. Đõy cũng là cụng trỡnh đầu tiờn tại Việt Nam đưa ra phương phỏp phõn lập và nhận dạng đến loài một số chủng vi khuẩn gõy sõu răng của người Việt Nam, làm cơ sở cho cỏc nghiờn cứu về sõu răng sau này. Cụng trỡnh nghiờn cứu của chỳng tụi cũng gợi mở những hướng nghiờn cứu tiếp theo bao gồm việc tiếp tục đi sõu nghiờn cứu cơ chế tỏc dụng của cỏc chất thức vật thứ cấp đó thu nhận được, cỏc đặc trưng dịch tễ của cỏc chủng
Streptococcus mutans phõn lập từ người Việt Nam, để từ đú cú những ứng dụng
KẾT LUẬN
Từ cỏc kết quả nghiờn cứu thu được chỳng tụi rỳt ra cỏc kết luận sau đõy:
1. Dịch chiết ethanol của Chàm tớa, Hương nhu trắng, Kim ngõn Quỷ trõm thảo, Sài đất, Sao đen và Sắn thuyền cú tỏc dụng ức chế sự sinh axit của vi khuẩn gõy sõu răng Streptococcus mutans GS-5, tỏc dụng này tăng lờn khi dịch chiết được phối hợp với NaF và H2O2. Cỏc dịch chiết thực vật này đều ức chế sự hỡnh thành biofilm và giết S. mutans GS-5 . Đặc biệt dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền cú tỏc dụng diệt S. mutans GS-5 ở pH 4 mạnh hơn gấp 6 lần ở pH 7. Dịch chiết Sắn thuyền và Sao đen cũng cú tỏc dụng giết một số loài vi khuẩn đường miệng khỏc như Streptococcus sanguis, Streptococcus gordonii, Streptococcus rattus.
2. Đó tỏch chiết, tinh sạch và xỏc định cấu trỳc hoỏ học được hai hợp chất thực vật thứ cấp thuộc thuộc nhúm oligostilben là hopea phenol (C56H42O12) và malibatol A (C28H20O7) từ dịch chiết vỏ Sao đen và một hợp chất thứ cấp nhúm terpene là axit asiatic (C30H48O5) từ dịch chiết Sắn thuyền.
3. Hopea phenol, malibatol A từ vỏ Sao đen và axit asiatic từ lỏ Sắn thuyền ức chế hoạt độ cỏc enzyme phosphoryl hoỏ đường-PTS (IC50 tương ứng 0,75 mM, 0,75 mM và 2,2 mM), lactate dehydrogenase (IC50 tương ứng 2,5 mM, 2,3 mM và 0,75 mM), pyruvate kinase (IC50 tương ứng 2,5 mM, 2,2 mM và 1,5 mM) liờn quan đến cỏc quỏ trỡnh sinh axit, ATPase (IC50 tương ứng 1,2 mM, 0,75 mM và 1,5 mM) liờn quan đến quỏ trỡnh chịu axit, NADH oxidase (IC50 tương ứng 1,5 mM, 1,0 mM và 1,0 mM) liờn quan đến quỏ trỡnh tiờu thụ oxy của Streptococcus mutans GS-5.
4. Đó phõn lập được 3 chủng vi khuẩn Streptococcus mutans H1, Streptococcus
mutans H2 và Streptococcus mutans H3 từ người Việt Nam nhờ việc nuụi
cấy vi khuẩn trờn mụi trường Mitis salivarius chọn lọc cú pH thấp, kết hợp cỏc phõn tớch hỡnh thỏi tế bào với phõn tớch đa hỡnh độ dài cỏc đoạn phõn cắt giới hạn gen mó húa cho ARNr 16S được nhõn bản bằng PCR. Chủng vi khuẩn Streptococcus mutans H2 cú trỡnh tự đoạn gen mó húa cho ARNr 16S
ở mức độ tương đồng 100% so với trỡnh tự đoạn gen này của Streptococcus
mutans đó cụng bố trong Genbank.
5. Tỏc dụng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền cũng như của axit asiatic, hopea phenol và malibatol A lờn chủng vi khuẩn Streptococcus mutans H2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
phõn lập từ người Việt Nam là tương tự như lờn chủng chuẩn Streptococcus
mutans GS-5 về khả năng ức chế sinh axit, giết vi khuẩn cũng như ức chế hoạt độ ATPase, PTS.
ĐỀ NGHỊ
Tiếp tục nghiờn cứu cơ chế tỏc dụng của axit asiatic từ Sắn thuyền (Syzygium
resinosum G.) và Hopea phenol, Malibatol A từ vỏ Sao đen (Hopea odorata R.) lờn
vi khuẩn gõy sõu răng Streptococcus mutans để cú thể ứng dụng chỳng vào việc bảo vệ răng, miệng.