C a,d ST3A axit asiatic
3.4.3.Nhận dạng một số chủng vi khuẩn Streptococcus mutans phân lập từ người Việt Nam bằng kỹ thuật đa hình
mutans phân lập từ người Việt Nam bằng kỹ thuật đa hình
độ dài các đoạn phân cắt giới hạn (RFLP) và kỹ thuật PCR
3.4.3.1. Tách ADN tổng số
Để tiếp tục nhận dạng một cách chính xác các chủng
Streptococcus sp H1, Streptococcus sp H2 và
Streptococcus sp H3, chúng tôi đã sử dụng đến kỹ thuật đa hình độ dài các đoạn phân cắt giới hạn (RFLP) và kỹ thuật PCR. Kết quả tách ADN tổng số từ các mẫu vi khuẩn và điện di trên gel agarose (hình 3.36) cho thấy một băng rõ nét, có kích thước trên 10kb chứng tỏ chế phẩm ADN thu được không bị phân cắt bởi nuclease và có độ sạch cao. Các mẫu ADN được sử dụng tiếp cho các nghiên cứu.
1. 2. 2.
Hỡnh 3.36. Điện di kiểm tra trờn gel agarose sản phẩm
ADN tổng số của cỏc chủng vi khuẩn Streptococcus
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 1kb Giếng 2: S. mutans GS-5
Giếng 3: S. sanguis NCTC-10904 Giếng 4: S. sp H1
Giếng 5: S. sp H2 Giếng 6: S. sp H3
3.
3.4.3.2. Nhận dạng Streptococcus mutans bằng kỹ thuật RFLP đoạn gen mã hoá cho ARN ribosome 16S.
Ở vi khuẩn núi chung và S. mutans trỡnh tự của ARNr 16S cú kớch thước
khoảng1.5 kb bao gồm cỏc vựng bảo thủ cao cú tớnh di truyền giữa cỏc loài sinh vật với nhau. Do đú việc sử dụng ARNr 16S là cơ sở phõn tử chớnh xỏc để xỏc định mối quan hệ họ hàng và tiến hoỏ giữa cỏc loài sinh vật trong đú cú S. mutans [173]. Trong nghiờn cứu này chỳng tụi tiến hành nhõn bản đoạn gen mó húa cho ARNr 16S bằng PCR, sau đú cắt sản phẩm PCR bẳng enzyme giới hạn để so sỏnh phổ băng của cỏc đối tượng nghiờn cứu so với mẫu chuẩn. Kỹ thuật này vỡ vậy được gọi chung là PCR-RFLP. Đõy là kỹ thuật sinh học phõn tử dễ thực hiện cú thể nhận dạng chớnh xỏc cỏc loài S. mutans.
Kết quả điện di trờn gel agarose 1% sản phẩm nhõn bản PCR của cỏc chủng S. mutans với cặp mồi 8UA và 1492R được thiết kế đặc hiệu cho đoạn gen ARNr 16S,
chỉ thu được một băng ADN nhõn bản duy nhất cú kớch thước khoảng 1,5 kb đỳng như tớnh toỏn lý thuyết (hỡnh 3.37). Như vậy, chỳng tụi kết luận đó nhõn bản thành cụng đoạn gen mó hoỏ cho ARNr 16S từ ADN hệ gen của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập được.
1
1 22 33 44 55 66
Hỡnh 3.37.Điện di trờn gel agarose cỏc sản phảm nhõn bản đoạn gen ARNr 16S của cỏc chủng vi
khuẩn Streptococcus
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 1kb Giếng 2: S. mutans GS-5 Giếng 3: S. sanguis NCTC-10904 Giếng 4: S. sp H1 Giếng 5: S. sp H2 Giếng 6: S. sp H3 1 1,,55kkbb
Sato và tập thể [173] đó phỏt triển phương phỏp nhận dạng cỏc loài trong nhúm mutans streptococus bằng kỹ thuật đa hỡnh độ dài cỏc đoạn giới hạn RFLP bằng việc sử dụng hai enzyme cắt giới hạn HpaII và HaeIII đối với đoạn gen mó hoỏ
ARNr 16S. Phương phỏp này cú thể giỳp phõn biệt được S. mutans và cỏc chủng
Streptococus khỏc. Cỏc sản phẩm PCR của đoạn gen ARNr 16S từ cỏc chủng vi khuẩn trờn được tinh sạch và cắt bằng HpaII và HaeIII, sau đú được điện di trờn gel agarose. Kết quả (hỡnh 3.38 và 3.39) cho thấy cả 3 chủng vi khuẩn Streptococcussp
H1, Streptococcus spH2 và Streptococcus sp H3 đều cho phổ băng tương tự chủng chuẩn S. mutans GS-5. Cụ thể, khi được cắt bằng HpaII, cả 3 chủng Streptococcus
sp H1, Streptococcus sp H2 và Streptococcus sp H3 đều cú 4 băng với kớch thước
lần lượt khoảng 120 bp, 130 bp, 300 bp và 500 bp, cũn khi được cắt bằng HaeIII thỡ 3 chủng này cho 4 băng với kớch thước lần lượt khoảng 120 bp, 300 bp, 400 bp và 500 bp. Phổ băng của cả 3 chủng khi cắt bằng 2 enzyme hoàn hoàn giống như phổ băng của S. mutans GS-5 và cũng phự hợp sự cú mặt của cỏc trỡnh tự nhận biết và phõn cắt của hai enzyme này khi so sỏnh với trỡnh tự gen mó húa của ANRr 16S trong ngõn hàng gen. Kết quả cũng cũn cho thấy phổ băng của 3 chủng này khỏc so với phổ băng của chủng chuẩn S. sanguis NCTC 10904 (cũng thuộc chi
Streptococcus).
1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1 22 33 44 55 6 6 11 22 33 44 55 6 6
Hỡnh 3.39. Điện di trờn gel agarose sản
phẩm PCR-RFLP đoạn gen mó hoỏARNr 16S sau khi cắt bằng HaeIII
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 1kb Giếng 2: S. mutans GS-5
Giếng 3: S. sangius NCTC-10904 Giếng 4: S. sp H1
Giếng 5: S. sp H2 Giếng 6: S. sp H3
Hỡnh 3.38. Điện di trờn gel agarose cỏc sản
phẩm PCR- RFLPđoạn gen mó hoỏARNr 16S sau khi cắt bằng HpaII
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 1kb Giếng 2: S. mutans GS-5 Giếng 3: S. sangius NCTC-10904 Giếng 4: S. sp H1 Giếng 5: S. sp H2 Giếng 6: S. sp H3 1 10000bbpp 5 50000bbpp 5 50000bbpp 1 10000bbpp
3.4.3.3. Nhận dạng cỏc chủng Streptococcus bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen dextranse của S. mutans
Để một lần nữa khẳng định chớnh xỏc cỏc chủng Streptococcus sp H1,
Streptococcus sp H2 và Streptococcus sp H3 là Streptococcus mutans chỳng tụi đó tiến hành PCR sử dụng cặp mồi SD1 và SD2 được thiết kết dựa trờn trỡnh tự hai đầu của gen mó hoỏ dextranase đặc hiệu cho S. mutans. Theo tớnh toỏn lý thuyết, với cặp mồi đặc hiệu SD1và SD2 sản phẩm PCR của gen mó hoỏ dextranase cỏc chủng S.
mutans sẽ cú kớch thước là 1272 bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR (hỡnh 3.40) cho
thấy cả 3 chủng Streptococcus sp H1, Streptococcus sp H2 và Streptococcus sp H3 đều cho duy nhất một băng với kớch thước khoảng 1,3 kb, tương tự băng ADN nhõn bản thu được từ chủng chuẩn S. mutans GS-5. Trong khi đú chủng S. sangius 10904 khụng cho băng nhõn bản 1,3 kb này. Kết quả này một lần nữa cho phộp chỳng tụi khẳng định chớnh xỏc rằng cả 3 chủng đều thuộc loài S. mutans và được ký hiệu
tương ứng là S. mutans H1, S. mutans H2 và S. mutans H3.
Như vậy qua kỹ thuật RFLP-PCR, PCR chỳng tụi kết luận đó phõn lập 3 chủng vi khuẩn gõy sõu răng S. mutans từ người Việt Nam.
Hỡnh 3.40. Điện di trờn gel agarose sản phẩm
nhõn bản bằng PCR gen dextranase của S. mutans
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 1kb Giếng 2: S. sanguis NCTC 10904 Giếng 3: S. mutans GS-5 Giếng 4: S. mutans H1 Giếng 5: S. mutans H2 Giếng 6: S. mutans H3 1 2 3 4 5 6 1 1,,55kkbb