- Tính chất hóa học của β glucan
2.3.5.Phương pháp nghiên cứu một số điều kiện tách chiết thu nhận polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.5.Phương pháp nghiên cứu một số điều kiện tách chiết thu nhận polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ
trong quả thể nấm Đầu khỉ
2.3.5.1. Phương pháp thu nhận polysaccharide trong mẫu quả thể nấm Đầu khỉ [68, 69]
Tiến hành chiết polysaccharide trong nấm Đầu khỉ bằng nước nóng và dung môi kiềm dựa trên cơ sở kinh nghiệm của một số các nhà khoa học [68, 69].
100 g quả thể nấm khô được nghiền nhỏ thành bột và được chiết trong thể tích 1 lít nước tại 100 C trong 8 giờ; Dịch chiết nấm được lọc qua vải, bã nấm tiếp tục được chiết như trên thêm 2 lần nữa; Dịch lọc của 3 lần chiết được gộp lại và cô tới thể tích 100 ml, sử dụng máy cô chân không tại 70 C, thu được dịch chiết nước nóng.
Polysaccharide được kết tủa bằng việc bổ sung 3 lần thể tích cồn tuyệt đối vào dịch chiết, ủ qua đêm tại 4 C. Polysaccharide được thu bằng ly tâm dịch tủa tại 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Kết tủa được rửa bằng methanol và hòa tan lại trong nước cất.
Phần bã nấm được bổ sung 1 lít NaOH 5% và ủ tại 56 C qua đêm; Phần dịch tan trong kiềm được thu lại bằng lọc qua vải; Bã nấm tiếp tục được chiết kiềm 2 lần nữa. Dịch lọc của 3 lần chiết kiềm được gộp lại, trung hòa bằng dung dịch axit axetic 1M tới pH 6,5- 7,0; sau đó polysaccharide được kết tủa bằng cách bổ sung 3 lần thể tích cồn tuyệt đối lạnh, ủ tại 4 C qua đêm; Ly tâm dịch đã tủa tại 10.000 vòng/phút trong 10 phút; Kết tủa được rửa lại bằng methanol và được hòa lại trong nước cất.
2.3.5.2. Lựa chọn hóa chất kiềm thích hợp
Để phát hiện sự có mặt của các polysacharide trong dịch chiết và nghiên cứu một số điều kiện tối ưu của dung môi chiết, sử dụng phương pháp đo độ nhớt bằng kế Ubelot. Chỉ tiêu thí nghiệm: lựa chọn hóa chất kiềm thích hợp cho quá trình chiết; Xác định nồng độ kiềm thích hợp cho quá trình chiết.
Chuẩn bị 3 mẫu, mỗi mẫu 10g bột Đầu khỉ khô thêm 100ml nước, lắc đều rồi chiết ở 100o
C trong thời gian 40 phút; Lọc lấy dịch, phần không tan cho thêm 200 ml dung dịch NaOH 2%; KOH 2%; Na2CO3 2%; Chiết kiềm ở 50oC trong 4 giờ. Dịch lọc mỗi mẫu thu được 160 ml (M1, M2 và M3 là các dịch chiết thu được bằng các dung dịch kiềm tương ứng là KOH, Na2CO3 và NaOH), được li tâm và đo độ nhớt, độ nhớt càng cao thì hiệu quả chiết càng cao.
2.3.5.3. Nghiên cứu nồng độ dung dịch NaOH thích hợp
Chuẩn bị 6 mẫu, mỗi mẫu 10 g bột Đầu khỉ khô và tiến hành chiết theo điều kiện như trên với sự thay đổi nồng độ của dung dịch NaOH (2%; 3%; 3,5%; 4%; 4,5% và 5%) tương ứng với dịch chiết thu được là M4, M5, M6, M7, M8 và M9; Li tâm dịch chiết thu lấy phần dịch trong và đo độ nhớt, độ nhớt càng cao thì hiệu quả chiết càng cao.
2.3 ẫu nấm (phương ph
phenol/axit sulphuric) [57]
100 ứ ,
tiếp theo 500 2SO4 ợ
Lấy 150 l dịch phản ứng cho vào giếng của phiến 96 giế ; Mẫu đối chứng được chuẩn bị tương tự dùng 100 l nước cất thay thế với mẫu thử ợ
glucose) để xác định
2.3.5.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết được thực hiện trên các phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và McKane, L., & Kandel (1996).
Chứng dương tính:
+ Streptomycin cho vi khuẩn Gr (+) + Tetracyclin cho vi khuẩn Gr (-)
+ Nystatin hoặc Amphotericin B cho nấm sợi và nấm men.
Kháng sinh pha trong dung dịch DMSO 10% với nồng độ thích hợp: Streptomycin: 4mM; Tetracyclin: 10mM; Nystatin: 4mM
Chứng âm tính: vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử
Tiến hành thí nghiệm:
- Các chủng kiểm định được hoạt hoá và pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland rồi tiến hành thí nghiệm.
- Các phiến thí nghiệm được nuôi trong tủ ấm 37oC/24 giờ cho vi khuẩn và 30o
C/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men.
Tính kết quả: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC-Minimum Inhibitory concentration) của mẫu:
Các mẫu được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, từ (5- 10) thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu thô có MIC ≤ 200 g/ml; mẫu tinh có MIC ≤ 50 g/ml là có hoạt tính.
Nồng độ ức chế 50% vi sinh vật (IC50) của mẫu có hoạt tính
Các mẫu có hoạt tính được pha loãng theo 10 thang nồng độ. Giá trị IC50 được xác định bằng chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển của vi sinh vật và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50.
2.3.5.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư người nuôi cấy invitro
Theo phương pháp của Skehan & CS (1990) và Likhiwitayawuid & CS (1993), hiện đang được áp dụng tại viện nghiên cứu ung thư quốc gia của Mỹ (NCI) và trường ĐH dược, ĐH tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ.
- Đánh thức các dòng tế bào; Hoà mẫu thí nghiệm vào dịch thể DMSO 100% (4- 10mg/ml) cho bước sàng lọc sơ bộ.
- Pha 10 thang nồng độ cho bước 2 để tính giá trị IC50
- Tế bào nuôi cấy cho phát triển tới mức 60 - 70%, thay môi trường sạch để hoạt hoá tế bào từ 18- 24 giờ, lúc đó tế bào đã sẵn sàng để thực hiện thí nghiệm.
- Tế bào được xử lý Tripsin 0,1% cho tách khỏi đáy bình. Hoà dịch thể huyền phù tế bào bằng môi trường sạch, rửa và đếm số lượng, pha tế bào nồng độ 3x104 tế bào/ml đối với dòng KB, 4x104 tế bào/ml đối với dòng FL.
- Thêm vào các giếng đã có chất chuẩn bị sẵn ở trên 190 μl dịch thể huyền phù tế bào. - Phiến được ủ trong tử CO2 thêm 3 ngày.
Tế bào khi ủ 3 ngày được cố định bằng dịch thể TCA lạnh (30 - 50%); Rửa, để khô, nhuộm SRB 0,4% trong axit acetic 1% và rửa lại bằng axit acetic 1% để loại mầu thừa; để khô, hoà lại bằng dịch thể đệm Tris base 10mm.
- Tính kết quả:
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo được của OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo công thức:
OD (mẫu) – OD (ngày 0)
CS% = x 100 OD (MSO) – OD (ngày 0)
Giá trị CS % sau khi tính theo công thức trên, được đưa vào tính toán exel để tìm ra % trung bình + - độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lăp lại 3 lần theo công thức của Ducan như sau: độ lệch tiêu chuẩn σ
√∑ (xi – x ) 2 σ =
n - 1
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50
Giá trị IC50: Dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50. Công thức: 1/y = a + blnX
Trong đó Y: nồng độ chất thử X: Giá trị CS (%)
2.3.5.7. Phương pháp kiểm tra hoạt tính ức chế hình thành khối u 3 chiều trên thạch mềm (anti-tumor promoting assay) in vivo [37, 46]
Theo tác giả Jong Bin Kim (2005) và Huiyuan Gao & CS, (2007) [37, 46], hiện đang được triển khai thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên.
Tóm tắt như sau: Tế bào nuôi trong môi trường MEM bổ xung 10% FBS ở 37o
C trong tủ ấm CO2 (5% CO2). Tế bào phát triển trong bình nuôi cấy 1 lớp, đạt đến phase Log, tế bào được tách khỏi bình và tách rời nhau bởi tripsin, đếm và hòa lại vào môi trường thạch loãng (0,35 % với thạch mặt và 0,5% với thạch nền) với nồng độ tế bào 3,33 x 103/ml. Trộn mẫu thử với nồng độ đầu 5- 25 µg/ml. Thí nghiệm được tiến hành trên phiến 96 giếng, lặp lại 2 - 3 lần. Sau 10-20 ngày lấy ra và nhuộm tế bào bằng tím kết tinh 0,005%, đọc kết quả dưới kính hiển vi ngược có gắn camera và nối ra máy tính. Hoạt tính ức chế hình thành khối u trên thạch được tính lặp lại 3 - 5 lần so sánh % số lượng khuẩn lạc hình thành khối u, kích thước khối u so với đối chứng (DMSO 1%).
2.3.5.8. Phương pháp nghiên cứu trên động vật thực nghiệm
Phương pháp của Abrham W.B.; Turner A. và theo quy định của WHO và Bộ Y tế về an toàn và hiệu lực của chế phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên [1, 18, 65]
a, Phương pháp nghiên cứu an toàn của HT1 trên thực nghiệm
Chọn thỏ khỏe mạnh, trọng lượng 2,0 0,2 kg; chia làm 2 nhóm, mỗi nhóm 8 con. + Nhóm chứng: uống dung môi dùng để pha chế phẩm nghiên cứu, liều 1ml/1kg trọng lượng cơ thể (TLCT)
+ Nhóm HT1: uống HT1 các mức liều trong thể tích 1ml/1kg TLCT (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong thời gian thí nghiệm, theo dõi chặt chẽ tình trạng chung, cân trọng lượng cơ thể hàng tuần, kiểm tra kết quả sinh hoá, huyết học, tình trạng tim mạch, so sánh với nhóm chứng. Thời gian theo dõi trong 6 tuần.
Lấy máu xét nghiệm các chỉ số sinh hóa, huyết học tại 3 thời điểm: xuất phát điểm, sau 3 tuần, sau 6 tuần nghiên cứu.
b, Phương pháp nghiên cứu bảo vệ phóng xạ của HT1
* Phương pháp chiếu xạ: Theo phương pháp được mô tả bởi Gonchavenko E.N và Vasin MV [31, 66] như sau:
Chuột nhắt trắng (CNT) được chiếu xạ (CX) bằng tia gamma từ nguồn Cobalt-60 trên máy tại bộ môn – khoa Phóng xạ - Viện Quân y 103 – Học viện Quân y; Liều chiếu xạ từ 5,5 Gy đến 8,5 Gy tùy theo mục đích nghiên cứu của từng nhóm.
* Các chỉ tiêu nghiên cứu tổng thể:
- Tính thời gian sống trung bình và tỷ lệ CNT sống sót sau chiếu xạ trong 30 ngày theo công thức của R.A. Besiadovskii (1978) và của Nguyễn Xuân Phách (1995) [15];
- Tính hệ số bảo vệ theo công thức của Burnazian A.I (1975) - Hệ số giảm liều (HSGL) được tính theo công thức:
LD50/30 nhóm nghiên cứu với HT1 HSGL =
LD50/30 nhóm chứng sinh học * Nghiên cứu một số chỉ tiêu về máu và tạo máu:
- Đếm số lượng hồng cầu (HC), bạch cầu (BC), tiểu cầu (TC) máu ngoại vi trên các máy xét nghiệm tự động.
- Trọng lượng lách, hạch lympho, tuyến ức CNT ở các ngày thứ 2, 4, 9 sau chiếu xạ, được cân trên cân chính xác.
- Mô học của lách, hạch lympho, tuyến ức CNT được tiến hành tại khoa giải phẫu bệnh lý – Học viện Quân y.
Sơ đồ thiết kế nghiên cứu: Nhóm I: Chứng sinh học (CSH) Nhóm II: Chiếu xạ đơn thuần
Nhóm III: Chiếu xạ có dùng HT1 bảo vệ trước, liều xạ 5,5 Gy Nhóm IV: Chiếu xạ có dùng HT1 bảo vệ trước, liều xạ 6,5 Gy Nhóm V: Chiếu xạ có dùng HT1 bảo vệ trước, liều xạ 7,5 Gy Nhóm VI: Chiếu xạ có dùng HT1 bảo vệ trước, liều xạ 8,5 Gy
Thời gian theo dõi sau chiếu xạ là 30 ngày, ghi lại số CNT sống/ CNT chết ở từng nhóm. Tính tỷ lệ thời gian CNT sống (trung bình);
Tính tỷ lệ thời gian CNT chết (trung bình);
Xét nghiệm chỉ tiến hành với các CNT còn sống sót tại các thời điểm kể trên tại các ngày thứ 2 và thứ 9 sau chiếu xạ;
Tính số CNT còn sống sau từng ngày cho đến ngày thứ 30;
Tại các thời điểm trên cân trọng lượng CNT, cuối kỳ autopsy tính trọng lượng các tạng lách, hạch, tuyến ức.