- Tính chất hóa học của β glucan
2.3.1.Phương pháp nghiên cứu tuyển chọn, xây dựng QTCN phân lập giống nấm Đầu khỉ
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1.Phương pháp nghiên cứu tuyển chọn, xây dựng QTCN phân lập giống nấm Đầu khỉ
2.3.1.1. Khảo nghiệm, tuyển chọn giống nấm Đầu khỉ
- Bốn giống nấm Đầu khỉ được lưu giữ tại Trung tâm công nghệ sinh học thực vật từ năm 2005 trên môi trường thuần khiết được nhân chuyển sang môi trường thóc (giống cấp 2) sau đó nuôi trồng thử nghiệm trên nguồn nguyên liệu mùn cưa và bông hạt có bổ sung phụ gia cám gạo, bột ngô; qui trình nhân giống và nuôi trồng áp dụng theo qui trình đã hoàn thiện của Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện Di truyền nông nghiệp.
- Khảo nghiệm cơ bản: thí nghiệm khảo nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, nhắc lại 3 lần; lấy mẫu ngẫu nhiên 50 bịch mỗi loại giống; định kỳ theo dõi 3 ngày 1 lần, điều tra theo phương pháp 5 điểm chéo góc, mỗi điểm 10 bịch.
Sử dụng phương pháp sàng lọc giống nấm Đầu khỉ thông qua các chỉ tiêu về hình thái quả thể, năng suất, khả năng thích nghi với điều kiện tự nhiên, khả năng chịu bệnh.
* Các chỉ tiêu theo dõi:
- Các chỉ tiêu về sinh trưởng, phát triển: + Thời gian mọc kín bịch.
+ Thời gian xuất hiện mầm quả thể. + Thời gian thu hái đợt 1.
+ Thời gian thu hái các đợt tiếp theo.
- Chỉ tiêu về mức độ nhiễm sâu bệnh.
Tỷ lệ nhiễm bệnh (%) = (Số bịch bị nhiễm bệnh/ Tổng số bịch) x 100
- Các chỉ tiêu về năng suất, chất lượng nấm. + Kích thước quả thể nấm (cm).
+ Trọng lượng nấm tươi/ bịch nguyên liệu (gam) + Tỷ lệ nấm khô/ tươi (%).
Bố trí 3 lần nuôi trồng lặp lại đối với bốn chủng Đầu khỉ nghiên cứu, mỗi lần 150 bịch nguyên liệu/ 1 chủng.
2.3.1.2. Phân lập lại (thuần khiết lại) giống nấm Đầu khỉ
Dựa vào kết quả nuôi trồng khảo nghiệm chọn ra giống nấm Đầu khỉ có khả năng thích ứng tốt với điều kiện khí hậu Việt Nam, hình thức quả thể đẹp, giá trị dinh dưỡng và dược liệu cao để tiến hành phân lập lại nguồn giống gốc sạch bệnh, chất lượng giống ổn định.
Chọn quả thể nấm to, chắc khoẻ, không sâu bệnh, hình thái cân đối mang đặc trưng điển hình của chủng giống ban đầu để tiến hành phân lập giống gốc. Quả thể nấm sau khi được khử trùng sơ bộ bằng cồn 70 độ và rửa lại bằng nước cất vô trùng, tiến hành thu bào tử nấm, mô nấm, hệ sợi nấm. Các công đoạn được tiến hành trong box cấy vô trùng; có 2 phương pháp phân lập giống gốc:
a. Phương pháp tách bào tử nấm [56]: đây là phương pháp dùng bào tử nấm cho nẩy mầm sinh hệ sợi nuôi thành giống gốc. Sau khi rửa sạch mẫu nấm, đưa mẫu vào cốc nuôi có sẵn giấy lọc đã thanh trùng để một ngày đêm, lấy mẫu nấm ra bào tử sẽ phát tán ra giấy thành dấu in bào tử màu trắng. Dùng que cấy chấm môi trường PGA dính vào bào tử rồi chuyển vào môi trường PGA. Hoặc cho bào tử rơi vào 10 ml nước cất vô trùng trong thời gian 24 giờ, dùng pipet lấy 0,1 ml dịch thể bào tử, pha trong nước cất vô trùng, nhỏ lên đĩa petri có môi trường nuôi cấy. Đĩa Petri được đánh dấu bằng các đường tròn ở mặt sau có đường kính 0.5 cm, mỗi 0,1 ml dịch thể bào tử nhỏ vào một đường tròn. Sau khi nuôi từ 12 – 24 giờ thì tiến hành đếm số lượng bào tử trong mỗi đường tròn. Từng bào tử trong mỗi đường tròn khi nảy mầm sẽ được tách riêng để cấy truyền sang môi trường mới. Kết quả thí nghiệm trong nghiên cứu này sẽ cho thấy số lượng bào tử trong mỗi 0,1ml dịch thể (từ 0 - 15 bào tử) và dễ dàng trong việc tách riêng từng bào tử.
Tiến hành phân tách từng bào tử nấm riêng biệt để nuôi cấy sang môi trường nuôi cấy nấm thuần khiết. Đem nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng tự nhiên; Theo dõi sinh trưởng của hệ sợi sinh ra từ từng bào tử ở các giai đoạn sinh trưởng của quả thể khác nhau; chọn lấy những mẫu có hệ sợi sinh trưởng khỏe, đều đặn, không nhiễm bệnh đem nuôi thuần hóa, nhân ra các cấp làm giống thí nghiệm nuôi trồng ra nấm thương phẩm.
b. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào [56]: sau khi rửa sạch mẫu nấm, tách đôi quả thể nấm bắng dao đã thanh trùng, cắt mô nấm đưa vào môi trường PGA, đem nuôi trong điều kiện thích hợp mỗi ngày kiểm tra một lần, chọn ra những ống giống bung sợi nhanh, phát triển đều, không nhiễm bệnh để cấy chuyển tiếp ra các cấp làm giống thí nghiệm nuôi trồng ra nấm thương phẩm.
Các chủng giống thuần thu được nhờ hai phương pháp phân lập trên đều phải trải qua quá trình nuôi trồng ra quả thể thử nghiệm nhiều lần, khi thấy được tính ưu việt của giống phân lập được mới đem dùng trong các thí nghiệm tiếp theo.
Môi trường sử dụng cho các thí nghiệm là môi trường PGA
Số mẫu cấy trong một công thức thí nghiệm là 30 mẫu, nhắc lại 3 lần
Chỉ tiêu theo dõi: thời gian nẩy mầm, tỉ lệ nhiễm, đặc điểm hệ sợi trên môi trường thuần khiết.
2.3.1.3. Nghiên cứu độ tuổi của quả thể nấm thích hợp để phân lập giống gốc
Lựa chọn quả thể nấm Đầu khỉ ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau để phân lập có ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng giống nấm cũng như khả năng nẩy mầm của bào tử và mô nấm. Trong thí nghiệm này sử dụng 4 giai đoạn tuổi khác nhau dùng để phân lập giống.
+ Giai đoạn 1: Quả thể vừa nhú mầm trên bịch nguyên liệu nuôi trồng (sau 5 - 7 ngày kể từ khi rạch hoặc nới nút bông cho ra quả thể)
+ Giai đoạn 2: Quả thể nấm còn non (3 - 5 ngày kể từ khi xuất hiện mầm quả thể). + Giai đoạn 3: Quả thể nấm trưởng thành nhưng chưa phát sinh bào tử (7 - 9 ngày kể từ khi xuất hiện mầm quả thể trên bịch nguyên liệu nuôi trồng).
+ Giai đoạn 4: Quả thể nấm chuyển sang giai đoạn già, phát sinh bào tử (11 - 13 ngày kể từ khi xuất hiện mầm quả thể trên bịch nguyên liệu nuôi trồng)
Xử lý mẫu nấm và lấy mô nấm cấy chuyển sang môi trường PGA Nuôi sợi ở nhiệt độ nuôi 25o
C± 2oC trong điều kiện không cần ánh sáng. Số mẫu cấy trong một thí nghiệm là 30 mẫu, thí nghiệm nhắc lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi: khả năng bung sợi, tốc độ mọc sợi, đặc điểm hệ sợi trên môi trường thuần khiết. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.1.4. Nghiên cứu các điều kiện nhân giống gốc nấm Đầu khỉ
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon, nito đến sinh trưởng của hệ sợi giống gốc: tiến hành cấy mô nấm vào các công thức môi trường ĐC 1, ĐC 2 có bổ sung các nguồn cacbon, nito khác nhau, nuôi sợi ở nhiệt độ 25o
C± 2oC trong điều kiện không cần ánh sáng.
- Nghiên cứu thành phần môi trường phân lập giống nấm Đầu khỉ: cấy mô nấm lên 5 công thức môi trường (bảng 2.1), nuôi sợi ở nhiệt độ 25o
C± 2oC trong điều kiện không cần ánh sáng.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng và tốc độ phát triển của hệ sợi giống nấm Đầu khỉ trên môi trường phân lập giống gốc: cấy mô nấm Đầu khỉ vào môi trường CT 3; nuôi sợi ở các nhiệt độ khác nhau: 20 ± 2oC, 24 ± 2oC, 28 ± 2oC.
- Các chỉ tiêu theo dõi: khả năng bung sợi, tốc độ mọc sợi, đặc điểm hệ sợi.
Tốc độ mọc sợi được tính bằng cách: đo đường kính lớn nhất, nhỏ nhất của vòng tròn lan sợi, lấy giá trị trung bình rồi chia cho tổng thời gian nuôi; đơn vị tính: mm/ngày