- Tính chất hóa học của β glucan
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể các cấp
thể các cấp
2.3.2.1. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 1 (dung tích 200 ml)
- Nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng: khử trùng ở chế độ nhiệt độ 115oC trong thời gian: 15 phút, 20 phút, 25 phút, 30 phút, 35 phút, 40 phút; lưu mẫu trong 30 ngày.
Chỉ tiêu theo dõi: mầu sắc môi trường sau khử trùng, tỉ lệ nhiễm sau thời gian lưu mẫu. - Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1: cấy giống vào các môi trường trình bầy ở bảng 2.2, nuôi ở điều kiện nhiệt độ 25 ±2oC, chế độ lắc 150 vòng/phút, thời gian nuôi 7 ngày.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1: Sử dụng công thức môi trường CT 8; chỉnh pH môi trường ở các giá trị: 4; 5; 6; 6,5; 7; 8; khử trùng, để nguội, cấy giống, nuôi ở điều kiện nhiệt độ 25 – 27oC, chế độ lắc 150 vòng/phút, thời gian nuôi 7 ngày.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1: sử dụng môi trường CT 8;
Giống cấy: 1 ống giống trên môi trường thạch thuần khiết nghiền nhỏ trong 100ml nước cất vô trùng, cấy vào môi trường dạng dịch thể với các tỉ lệ: 2%, 4%, 6%, 8% theo thể tích.
Nuôi ở điều kiện nhiệt độ 25 – 27oC, chế độ lắc 150 vòng/phút, thời gian nuôi 7 ngày. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1: Sử dụng CT 8, tỉ lệ giống cấy: 4% theo thể tích.
Nuôi ở các điều kiện nhiệt độ 20±2o
C, 24±2oC, 28±2oC, 32±2oC
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ nuôi đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1: sử dụng môi trường CT 8, tỉ lệ giống cấy: 4% theo thể tích, nuôi ở điều kiện nhiệt độ 24±2o
Các chế độ nuôi: + Nuôi tĩnh
+ Nuôi trên máy khuấy từ: con khuấy kích thước 2 cm, tốc độ khuấy 150 vòng/ phút
+ Nuôi lắc: 150 vòng/phút
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ lắc và chế độ khuấy đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1
+ Nuôi trên máy khuấy từ: sử dụng con khuấy kích thước 2 cm, tốc độ khuấy thay đổi theo các mức: 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 vòng/ phút.
+ Nuôi lắc: nuôi giống trên máy lắc với các tốc độ lắc: 110, 120, 130, 140,150, 160, 170, 180 vòng/ phút.
- Nghiên cứu đường cong sinh trưởng của nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1: Sử dụng môi trường CT 8, tỉ lệ giống cấy 4% theo thể tích, nuôi ở điều kiện nhiệt độ 24±2o
C, chế độ nuôi lắc tốc độ 150 vòng/ phút.
Xác định sinh khối sợi, quan sát hình thái sợi trong suốt quá trình nuôi cấy: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ, 144 giờ, 168 giờ, 192 giờ, 216 giờ, 240 giờ; dựng đường cong sinh trưởng của giống trong môi trường nuôi dưỡng dạng dịch thể.
2.3.2.2. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 2 (dung tích 2000 - 5000 ml)
- Nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng: Khử trùng ở chế độ nhiệt độ 115oC trong thời gian: 30 phút, 40 phút, 50 phút, 60 phút; lưu mẫu trong 30 ngày.
* Chỉ tiêu theo dõi: mầu sắc môi trường sau khử trùng, tỉ lệ nhiễm sau thời gian lưu mẫu. - Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2: cấy giống vào các môi trường trình bầy trong bảng 2.3, nuôi ở điều kiện nhiệt độ 25 – 27oC, có sục khí, thời gian nuôi 7 ngày.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi giống trung gian cấp 1 dạng dịch thể dùng để cấy chuyển đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2: Sử dụng công thức môi trường CT 12;
Cấy giống trung gian cấp 1 dạng dịch thể ở các thời điểm: giống sau 72 giờ nuôi (3 ngày); 96 sau giờ nuôi (4 ngày), giống sau 120 giờ nuôi (5 ngày); giống sau 144 giờ nuôi (6 ngày)
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2: sử dụng môi trường CT 12;
Cấy chuyển giống trung gian cấp 1 dạng dịch thể được nuôi sau 120 giờ nuôi (5 ngày) sang môi trường nhân giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể với các tỉ lệ sau: 3%, 5%, 7%, 10% so với thể tích;
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ sục khí đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2: Sử dụng môi trường CT 12
Các chế độ sục khí: 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7 (đơn vị tính: lít khí/ 1 lít môi trường/ 1 phút) - Nghiên cứu tác dụng của chất phá bọt trong quá trình nhân giống Đầu khỉ trung gian cấp 2: sử dụng CT 12; chất phá bọt sử dụng: Tween 80 (1ml/lít môi trường), antifoam (0,5 ml/lít môi trường); soybean oil wasted powder (1 g/lít môi trường); dầu đậu tương (0,5 ml/lít môi trường)
- Nghiên cứu đường cong sinh trưởng của nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2: Sử dụng CT 12, chất phá bọt sử dụng: dầu đậu tương (0,5 ml/lít môi trường)
Cấy chuyển giống trung gian cấp 1 dạng dịch thể được nuôi sau 120 giờ nuôi (5 ngày), tỉ lệ 7% so với thể tích
Chế độ sục khí: 0,5 lít khí/ 1 lít môi trường/ 1 phút
Xác định sinh khối sợi, quan sát hình thái sợi trong suốt quá trình nuôi cấy: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ, 144 giờ, 168 giờ, 192 giờ, 216 giờ, 240 giờ; dựng đường cong sinh trưởng của giống trong môi trường nuôi dưỡng dạng dịch thể.
2.3.2.3. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể sử dụng trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp (dung tích 120 lít)
- Nghiên cứu thành phần môi trường nuôi cấy cho nhân giống thể tích 120 lít: sử dụng các môi trường trong bảng 2.4
Cấy giống, nuôi sợi ở nhiệt độ 24±2oC, sục khí 0,5lít khí/1 lít môi trường/1phút. Chỉ tiêu theo dõi: tốc độ mọc của sợi (được đánh giá dựa trên sinh khối sợi trong 100 ml dịch, sau 5 ngày nuôi)
- Nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể, dung tích 120 lít: Sử dụng CT 16
Khử trùng ở chế độ nhiệt độ 121oC trong thời gian: 60 phút, 70 phút, 80 phút, 90 phút; Lưu mẫu trong 10 ngày
Chỉ tiêu theo dõi: mầu sắc môi trường sau khử trùng, tỉ lệ nhiễm sau thời gian lưu mẫu. - Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể dùng để cấy chuyển đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trong bình lên men dung tích 120 lít: Sử dụng CT 16; khử trùng ở chế độ nhiệt độ 121oC trong thời gian: 80 phút.
Cấy giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể ở các thời điểm: giống sau 72 giờ nuôi (3 ngày); 96 sau giờ nuôi (4 ngày), giống sau 120 giờ nuôi (5 ngày); giống sau 144 giờ nuôi (6 ngày); 168 giờ (7 ngày).
Nuôi giống ở điều kiện nhiệt độ 24±2o
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trong bình lên men dung tích 120 lít: sử dụng CT 16;
Cấy giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể sau 120 giờ nuôi (5 ngày) sang môi trường nhân giống dung tích 120 lít với các tỉ lệ sau: 5, 10, 15, 20% (so với thể tích)
Nuôi giống ở điều kiện nhiệt độ 24±2o
C, có sục khí.
- Nghiên cứu đường cong sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trong bình lên men dung tích 120 lít: Sử dụng môi trường CT 16.
Cấy giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể sau 120 giờ nuôi (5 ngày) sang môi trường nhân giống dung tích 120 lít với tỉ lệ 15% so với thể tích.
Nuôi giống ở điều kiện nhiệt độ 24±2o
C, có sục khí.
Xác định sinh khối sợi, quan sát hình thái sợi trong suốt quá trình nuôi cấy: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ, 144 giờ, 168 giờ, 192 giờ, 216 giờ, 240 giờ; dựng đường cong sinh trưởng của giống trong môi trường nuôi dưỡng dạng dịch thể.
* Các chỉ tiêu theo dõi trong nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể các cấp
- Tốc độ mọc của sợi: được đánh giá dựa trên sinh khối sợi trong 100 ml dịch, sau 7 ngày nuôi;
- Đặc điểm của hệ sợi: soi khuẩn lạc cầu (KLC) trên kính hiển vi soi nổi để đánh giá - Kích thước khuẩn lạc cầu: gắp khuẩn lạc cầu cho vào nước cất, để khuẩn lạc cầu trương nở hết cỡ, đưa lên máy kính lúp có thang đo để đo.
- Mật độ khuẩn lạc cầu: đếm trực tiếp số khuẩn lạc cầu trong 10 ml dịch nuôi, trong trường hợp số khuẩn lạc cầu quá lớn sử dụng phương pháp pha loãng sau đó đếm trực tiếp.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 mẫu/ 1 công thức.
2.3.2.4. Phương pháp kiểm tra chất lượng giống nấm dạng dịch thể a, Kiểm tra độ thuần khiết của dịch nuôi
Soi dịch nuôi dưới kính hiển vi, kiểm tra để xác định xem vi khuẩn có tồn tại trong dịch nuôi hay không. Phương pháp này nhanh, có thể kịp thời biết được kết quả kiểm tra. Cấy trực tiếp dịch nuôi vào môi trường PGA trên đĩa petri, hoặc nuôi dưỡng trong môi trường nước thịt có pepton; Sau thời gian 24 - 48 giờ kiểm tra sẽ cho biết có hay không tạp khuẩn gây nhiễm trong quá trình lên men.
b,Kiểm tra khả năng phát triển của hệ sơi
Dùng kính hiển vi, kính lúp soi nổi để quan sát mép ngoài của khuẩn lạc cầu (hệ sợi nấm hình cầu), quan sát sự phân nhánh và đo kích thước của khuẩn lạc cầu.
c,Kiểm tra kích thước hệ sợi hình cầu (khuẩn lạc cầu)
Lấy mẫu, lọc, rửa, cho một lượng nhỏ khuẩn lạc cầu vào trong đĩa petri, thêm nước cất để khuẩn lạc cầu nở ra, căng hết cỡ; đo kích thước lớn nhỏ của khuẩn lạc cầu dưới đĩa petri trên kính lúp có thang đo.
d,Kiểm tra tốc độ sinh trưởng của hệ sợi
Tốc độ sinh trưởng và phát triển được xác định thông qua trọng lượng khô của hệ sợi nấm trên một đơn vị dịch nuôi. Lấy100 ml dịch nuôi cần kiểm tra, lọc lấy phần sợi nấm, dùng nước xịt rửa cặn bám, ly tâm, lọc lấy sợi nấm, sấy khô rồi cân.
e, Xác định mật độ khuẩn lạc cầu
Mật độ khuẩn lạc cầu trong một đơn vị thể tích dịch nuôi cũng là chỉ tiêu để đánh giá tốc độ sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm trong môi trường nhân giống; để xác định được mật độ khuẩn lạc cầu tiến hành rót một lượng mẫu nhất định, đếm trực tiếp số khuẩn lạc cầu trong mẫu, có thể pha loãng mẫu để đếm trong trường hợp số lượng khuẩn lạc cầu quá lớn.
f,Kiểm tra mùi khí thoát ra của dịch lên men
Kiểm tra tại lỗ thoát khí của bình lên men, thấy khí có mùi thơm dễ chịu đặc trưng của sợi nấm bay ra là dịch lên men bình thường; nếu như sau 12 tiếng lên men, ngửi thấy có mùi chua thối, điều này chứng tỏ rằng dịch nuôi dưỡng đã bị nhiễm.
g,Đo pH:dùng giấy kiềm hoặc máy đo pH.
ơ2.3.3. Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp sử dụng giống nấm dạng dịch thể
2.3.3.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu nuôi trồng nấm Đầu Khỉ [3, 8, 9, 11]
- Mùn cưa, lõi ngô nghiền nhỏ, bông hạt được làm ẩm bằng nước vôi trong pH 10 – 11, với định lượng 4kg vôi/1000 lít nước, ủ 1 - 3 ngày, đảo đều, ủ tiếp 1 - 3 ngày.
- Bã mía: tạo ẩm bằng nước vôi trong rồi dùng luôn, tránh ủ qua đêm làm chua nguyên liệu.
Độ ẩm nguyên liệu sau ủ đạt 65 - 67%, nguyên liệu đã được xử lý tiến hành phối trộn phụ gia theo các công thức thí nghiệm, sau đó đóng túi 19 x 33 cm, mỗi bịch nguyên liệu có khối lượng 750 - 800 gam, độ nén nguyên liệu vừa phải sao cho chiều cao nguyên liệu sau khi đóng túi đạt 22 – 24 cm.
Khử trùng nguyên liệu
Cấy giống: Cấy giống nấm dạng dịch thể chất lượng tốt; các mẫu đối chứng cấy giống dạng hạt được sản xuất tại Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp.
Nuôi sợi: Bịch cấy giống xong được nuôi trong phòng có điều kiện tối, ở nhiệt độ thích hợp.
Thu hái: thu hái đúng độ tuổi khi nấm chưa phát tán bào tử trắng.
Sơ chế: sấy khô ở nhiệt độ 40 – 45oC trong 4 giờ để làm giảm lượng nước, sau đó tăng dần nhiệt độ để sấy nấm đến khô kiệt, nhiệt đô sấy tối đa 65o
C.
Bảo quản: Bảo quản nấm Đầu khỉ tươi ở nhiệt độ 3 - 6oC trong nhiều nhất 7 ngày; bảo quản nấm khô trong túi nylon kín ở nơi khô thoáng, điều kiện tự nhiên.
2.3.3.2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp, sử dụng giống nấm dạng dịch thể
- Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất phối trộn đến sự sinh trưởng, phát triển và khả năng nhiễm bệnh của nấm Đầu khỉ trong giai đoạn nuôi trồng thu quả thể: sử dụng CTNT 1, phối trộn nguyên liệu đồng đều, tạo ẩm nguyên liệu ở các ngưỡng khác nhau: 50%±2%, 55±2%, 60±2%, 65±2%, 70±2%.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng phối trộn và phương pháp khử trùng đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong quá trình nuôi trồng thu quả thể: phối trộn các nguyên liệu theo các công thức như bảng 2.5; độ ẩm 65±2%.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy vào bịch nguyên liệu đến sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong giai đoạn nuôi trồng thu quả thể:
Sử dụng môi trường CTNT 3, khử trùng bằng nồi hấp áp lực áp suất 1,3 – 1,4 atm trong 3,5 giờ.
Cấy giống: Sử dụng giống nấm dịch thể nuôi 4 - 5 ngày cấy chuyển vào bịch nguyên liệu nuôi trồng với các thể tích giống cấy: 10ml / bịch, 15ml/ bịch, 20ml/ bịch, 25ml/ bịch, 30ml/bịch, 35ml/ bịch; Mẫu đối chứng cấy giống nhân trên cơ chất hạt với định lượng 5 gam giống/ bịch; mỗi bịch nguyên liệu có khối lượng 800 gam;
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong giai đoạn nuôi trồng: sử dụng CTNT 3, khử trùng, cấy giống: 25 ml giống / bịch nguyên liệu; Nuôi sợi trong điều kiện nhiệt độ: 18 - 21o
C, 22 - 25oC; 26 - 29oC, 30 – 34o C. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Đầu khỉ: sau thời gian nuôi sợi, khi sợi có xu hướng bám vào nút bông thì bắt đầu nới lỏng nút bông, để lại 1/3 lượng bông trên cổ nút để giữ ẩm và làm chỗ bám cho ra quả thể; chuyển bịch vào phòng cho ra quả thể có thể điều chỉnh nhiệt độ ở các ngưỡng: 16-18o
C; 20-22oC; 24-26oC; 28-30oC.
2.3.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm:
Các thí nghiệm được bố trí 3 lần nhắc lại và được tiến hành như sau:
Mỗi công thức thí nghiệm bố trí 150 bịch nguyên liệu (800 gam/bịch). Theo dõi các chỉ tiêu nghiên cứu với số lượng 50 bịch/công thức thí nghiệm, lấy mẫu theo 5 điểm của đường chéo, mỗi điểm 10 bịch.
Các chỉ tiêu theo dõi:
- Theo dõi các đặc điểm sinh trưởng của hệ sợi - Tỉ lệ nhiễm: được tính theo công thức
Tổng số mẫu nhiễm
Tỉ lệ nhiễm (%) = x 100% Tổng số mẫu thí nghiệm
- Thời gian ươm sợi, ký hiệu T1 (ngày) được tính từ khi cấy giống đến khi hệ sợi mọc kín toàn bộ bịch nguyên liệu nuôi trồng.
- 1
D: Chiều cao bịch nguyên liệu (mm) T1: Thời gian ươm sợi (ngày)
- Thời gian hình thành mầm quả thể nấm, ký hiệu T2 (ngày): tính từ khi hệ sợi mọc kín bịch nguyên liệu đến khi thấy xuất hiện mầm quả thể ở vết rạch hay trên cổ nút bịch nguyên liệu.
- Thời gian quả thể trưởng thành, ký hiệu T3 (ngày): tính từ khi xuất hiện mầm quả