- Tính chất hóa học của β glucan
C Thời gian
b. Hình thái hệ sợi của giống trung gian cấp 1 nuôi trên máy khuấy từ khi cấy
C Thời gian
chất lượng môi trường sau khi khử trùng và sau 30 ngày lưu mẫu.
Kết quả được trình bày trong bảng 3.20.
Bảng 3.20: Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng (dung tích 2000 – 5000 ml)
Khử trùng ở 115o
C Thời gian Thời gian
Chỉ tiêu theo dõi 30 40 50 60 - 70
Mầu sắc môi trường + ++ +++ ++++ Tỷ lệ nhiễm khi lưu mẫu 1/10 mẫu 1/10 mẫu 0/10 mẫu 0/10 mẫu
* Ghi chú:
(+) Độ đậm màu của dịch sau khử trùng không khác biệt so với trước khử trùng
(++) Độ đậm màu của dịch sau khử trùng đậm hơn một chút so với trước khử trùng, dịch có mùi thơm tự nhiên
(+++) Độ đậm màu của dịch sau khử trùng đậm hơn nhiều so với trước khử trùng, dịch sau khử trùng có mùi thơm đặc trưng.
(++++) Độ đậm màu của dịch sau khử trùng đậm hơn rất nhiều so với trước khử trùng, dịch sau khử trùng chuyển mầu nâu đỏ, có mùi thơm đặc trưng.
Hình 3.22:Môi trường khử trùng ở 115oC trong thời gian lần lượt là 30, 40, 50, 60, 70phút (tính từ trái sang phải
của hình)
Hình 3.23: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trong môi trường khử trùng ở 115oC trong thời gian 70 phút và môi trường khử trùng ở
115oC trong thời gian 70 phút (tính từ trái sang phải của hình)
Kết quả cho thấy khử trùng ở nhiệt độ 115o
C trong 50 phút là thích hợp nhất vì ở điều kiện khử trùng này môi trường dinh dưỡng vừa đảm bảo vô trùng mà chất lượng môi trường vẫn được bảo đảm; Lựa chọn điều kiện khử trùng ở nhiệt độ 115oC trong 50 phút để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2.2. Kết quả nghiên cứu thành phần môi trường nhân giống trung gian cấp 2 nấm Đầu khỉ dạng dịch thể
Nhằm giảm chi phí trong sản xuất mà vẫn đảm bảo được chất lượng giống, tiến hành các nghiên cứu nhằm tìm được môi trường nhân giống Đầu khỉ trung gian cấp 2 với dung tích 2000 – 5000ml; Dựa trên thành phần môi trường nhân giống Đầu khỉ trung gian cấp 1, chúng tôi thay thế pepton Đức bằng pepton Trung Quốc với các tỉ lệ khác nhau;
Chuẩn bị các môi trường dinh dưỡng theo công thức trong bảng 2.3; khử trùng môi trường, cấy giống, nuôi giống ở nhiệt độ 24±2oC, sục khí 0,5l/1lit môi trường/1phút. Theo dõi sự sinh trưởng phát triển của giống.Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.21 sau;
Bảng 3.21: Sự sinh trưởng giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau
Chỉ tiêu Công thức
Sinh khối sợi
(gam/100ml/7ngày) Kích thƣớc KLC (mm) CT 10 0,45 1,3 CT 11 0,52 1,3 CT 12 0,57 1,3 CT 13 0,55 1,3 CV% 3,9 LDS0,05 0,412
Giống nấm Đầu khỉ sinh trưởng tốt trên công thức CT 12 có thành phần: Glucose: 15g; Pepton TQ: 4g; MgSO4 .7H2O: 1g; KH2PO4: 1g; K2HPO4: 1g; (NH4)2HPO4: 1g; thiamin:20 µg; nước cất:1000 ml, pH 6,5; sinh khối sợi và sinh lực giống có kết quả vượt trội hơn hẳn so với các công thức còn lại. Ở các môi trường CT13 khi tiếp tục tăng hàm lượng các chất dinh dưỡng thì sinh khối sợi không tăng; lựa chọn công thức CT 12 để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.24: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trong các công thức môi trường dinh dưỡng khác nhau (dịch 7 ngày nuôi)
3.2.2.3. Kết quả nghiên cứu tuổi giống trung gian cấp 1 dạng dịch thể cấy chuyển sang giống trung gian cấp 2
Sử dụng môi trường CT12, khử trùng 115oC thời gian 50 phút; cấy giống với độ tuổi giống khác nhau; Bố trí thí nghiệm như đã trình bầy ở phần 2.3.2.2; Kết quả được ghi nhận ở bảng sau:
Bảng 3.22: Ảnh hưởng của tuổi giống trung gian cấp 1 dạng dịch thể cấy chuyển sang giống trung gian cấp 2 đến chất lượng giống trong CT12
Chỉ tiêu Tuổi giống (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sinh khối sợi
(g/100ml/7ngày)
Kích thƣớc KLC
(mm) Đặc điểm giống
72 giờ (3 ngày) 0,65 1,3 Hệ sợi phát triển đồng đều, khuẩn lạc cầu tròn đều, có gai tua xung quanh; mầu sắc của khuẩn lạc cầu trắng đục đồng nhất. 96 giờ (4 ngày) 0,69 1,3 120 giờ (5 ngày) 0,73 1,3 144 giờ (6 ngày) 0,72 1,3 CV% 3,8 LDS0,05 0,525
Sử dụng giống trung gian cấp 1 dạng dịch thể trong giai đoạn phát triển mạnh mẽ nhất để cấy chuyển sang môi trường nhân giống trung gian cấp 2 có tác dụng làm tăng khả năng thích ứng của giống trong môi trường mới, rút ngắn thời gian của pha thích nghi, đồng thời kích thích sự tăng sinh của giống; Sử dụng giống cấy chuyển có sinh lực tốt cũng góp phần làm giảm tỷ lệ nhiễm, kéo dài thời gian của pha sinh trưởng và pha cân bằng, qua đó kéo dài thời gian sử dụng giống nấm dạng dịch thể. Qua kết quả thu được khi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi giống trung gian cấp 1 dùng để cấy chuyển sang giống trung gian cấp 2 cho thấy: sử dụng giống đang ở giai đoạn từ 3 đến 6 ngày tuổi đều cho kết quả tốt, tốt nhất là sử dụng giống ở giai đoạn 5 ngày tuổi.
3.2.2.4. Kết quả xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp khi cấy chuyển sang môi trường dịch thể
Tỷ lệ giống cấy có ảnh hưởng rõ rệt tới tốc độ sinh trưởng của giống nấm và đặc điểm hệ sợi trong môi trường dịch thể; Tỷ lệ giống cấy quá cao hay quá thấp đều làm giảm tốc độ sinh trưởng của giống cũng như làm thay đổi kích thước của khuẩn lạc cầu; Để xác định tỷ lệ giống trung gian cấp 1 cấy chuyển sang môi trường nhân giống trung gian cấp 2 thích hợp, bố trí thí nghiệm như đã trình bầy ở phần 2.3.2.2; Kết quả thu được ghi nhận ở bảng 3.23, hình 3.25 và hình 3.26 sau đây.
Bảng 3.23: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến kích thước và đặc điểm hệ sợi nấm Đầu khỉ trong CT12 Tỷ lệ Chỉ tiêu 3% 5% 7% 10% KLC (mm) 1,5 - 2 1,3 - 1,45 1,0 1,0 Đặc điểm hệ sợi
Hệ sợi xuất hiện sau 2 ngày cấy giống, tốc độ phát triển nhanh, mật độ thưa, kích thước các KLC khá to, đồng đều.
Hệ sợi xuất hiện sau 2 ngày cấy giống, tốc độ phát triển nhanh, mật độ nhiều, KLC có kích thước trung bình, phát triển đồng đều.
Hệ sợi xuất hiện sau 2 ngày cấy giống, tốc độ phát triển nhanh, mật độ dày đặc, kích thước các KLC nhỏ li ti.
Trong quá trình nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy chuyển cho thấy, với tỉ lệ giống 5-7% so với thể tích cho lượng sinh khối lớn, kích thước khuẩn lạc cầu vừa phải, đạt từ 1,0 – 1,45mm. Theo một số nghiên cứu đã được công bố thì kích thước khuẩn lạc cầu không nên quá to hay quá nhỏ, kích thước thích hợp của khuẩn lạc cầu trong khoảng 1,2 – 1,7 mm là tốt nhất.
Hình 3.25: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến sinh khối hệ sợi nấm trong môi trường CT12
Như vậy lựa chọn tỷ lệ giống cấy 5% - 7% theo thể tích để tiếp tục các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.26: Giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 trong môi trường CT12 sau 7 ngày nuôi (Tính từ trái sang phải của hình: tỉ lệ giống cấy 3%, 5%, 7%, 10%)
3.2.2.5. Kết quả nghiên cứu chế độ sục khí cho bình lên men dung tích 2-5 lít
Sử dụng CT 12; cấy chuyển giống trung gian cấp 1 dạng dịch thể được nuôi sau 120 giờ nuôi (5 ngày), với tỉ lệ 7% thể tích
Nuôi giống trung gian cấp 2 ở điều kiện nhiệt độ 24±2oC,
Các chế độ sục khí: 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7 (đơn vị tính: lít khí/1 lít môi trường/ 1 phút) Chỉ tiêu theo dõi: tốc độ mọc của sợi; đặc điểm của hệ sợi, kích thước khuẩn lạc cầu, khả năng tạo bọt.
Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.24 sau;
Bảng 3.24: Ảnh hưởng của chế độ sục khí đến sự sinh trưởng của giống dịch thể trong môi trường CT12 (cho bình lên men dung tích 5lit)
Thể tích khí
(lít/1lit/1phút)
Sinh khối sợi
(g/5l/7 ngày)
Kích thƣớc KLC (mm)
Mức độ
tạo bọt Mức độ khuấy đảo giống
0,2 9,62 1,0 + (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sự chuyển động của giống trong bình lên men kém, giống có xu hướng chìm xuống dưới đáy bình lên men, liên kết với nhau tạo thành từng mảng lớn.
0,3 10,35 1,2 +
0,4 11,7 1,4 + Sự chuyển động của giống trong bình lên men tốt, giống chuyển động liên tục, tạo thành hệ sợi hình cầu.
0,5 13,2 1,45 ++
0,6 13,5 1,45 +++
Mức độ chyển động của giống trong môi trường tốt nhưng tạo nhiều bọt đẩy giống ra ngoài lỗ thoát khí.
0,7 13,6 1,45 ++++
CV% 2,8
Hình 3.27: Ảnh hưởng của chế độ sục khí đến sự sinh trưởng của giống dịch thể trong môi trường CT12 và mức độ tạo bọt; (Từ trái sang phải của ảnh: chế độ sục khí 0,3 lit khí/1l dịch nuôi/phút; 0,4 lit khí/1l dịch nuôi/phút; 0,5 lit khí/1l dịch nuôi/phút; 0,6 lit khí/1l dịch
nuôi/phút; 0,7 lit khí/1l dịch nuôi/phút).
Kết quả ở bảng 3.24 và hình 3.27 cho thấy thể tích khí cung cấp cho quá trình lên men có ảnh hưởng lớn tới sự sinh trưởng cũng như kích thước của khuẩn lạc cầu; Sinh khối sợi tăng khi thể tích sục khí tăng từ 0,2 lít/1lit dịch nuôi/phút đến 0,6 lít/1lit dịch nuôi/phút; Tiếp tục tăng thể tích khí lên 0,7 lít/1lit dịch nuôi/phút sinh khối sợi nấm tăng không đáng kể mà còn tạo nhiều bọt, gây cản trở cho quá trình hòa tan oxy, đồng thời đẩy giống phát triển trên thành bình nuôi, thậm chí đẩy giống tràn ra ngoài qua lỗ thoát khí; Tốc độ sục khí mạnh cũng có khả năng làm tăng tỷ lệ nhiễm do màng lọc khí bị thủng. Với lượng khí cung cấp từ 0,2 – 0,3 lít/1lit dịch nuôi/phút sinh khối sợi ít, không có sự chuyển động trong môi trường nuôi cấy, giống có xu hướng chìm dưới đáy bình, liên kết với nhau tạo thành từng mảng. Với lượng khí 0,4 - 0,5lit khí/1lit dịch nuôi/phút cho kết quả tốt nhất.
Từ kết quả thu được, NCS lựa chọng chế độ sục khí 0,4 - 0,5lit khí/1lit dịch nuôi/phút để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2.6. Kết quả nghiên cứu tác dụng của chất phá bọt trong quá trình nhân giống Đầu khỉ trung gian cấp 2 (cho bình lên men dung tích 2-5 lít)
Để nghiên cứu tác dụng của chất phá bọt trong quá trình nhân giống Đầu khỉ trung gian cấp 2, bố trí thí nghiệm như đã trình bày ở phần 2.3.2.2; Sử dụng công thức môi trường CT 12; Chế độ sục khí 0,4-0,5 lít khí/1 lít môi trường/1 phút;
Các chất phá bọt sử dụng: Tween 80 (1ml/lít môi trường), Antifoam (0,5 ml/lít môi trường); Soybean oil wasted powder (1 g/lít môi trường); Dầu đậu tương (0,5 ml/lít môi trường)
Bảng 3.25: Ảnh hưởng của chất phá bọt trong quá trình nhân giống Đầu khỉ trung gian cấp 2 STT Chất phá bọt Mức độ tạo bọt Ảnh hƣởng tới giống nấm 1 Không sử dụng chất phá bọt +++ - 2 Tween 80 (1ml/lít môi trường) ++ Không 3 Antifoam (0,5 ml/lít môi trường) - Không 4 Soybean oil wasted powder (1 g/lít môi
trường)
+ Làm đục dịch nuôi 5 Dầu đậu tương (0,5 ml/lít môi trường) - Không
a. Bổ sung dầu đậu tương làm chất phá bọt. b. Không bổ sung chất phá bọt Hình 3.28: Tác dụng của chất phá bọt trong quá trình lên men có sục khí,
chế độ sục khí 0,4-0,5lit khí/1lit dịch nuôi/phút
Do tác động của sục khí và quá trình lên men tạo ra CO2 nên hình thành bọt khí trên bề mặt dịch nuôi, tốc độ sục khí càng mạnh thì tạo bọt càng nhiều; Bọt khí làm giảm khả năng trao đổi chất qua đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm, bên cạnh đó nó còn làm giảm hiệu suất sử dụng thiết bị lên men thậm chí nếu tạo quá nhiều bọt còn gây tràn dịch làm hỏng màng lọc, gây nhiễm giống. Để đảm bảo cho việc cung cấp đủ khí cho sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi mà không tạo bọt trong quá trình lên men thì việc bổ sung chất phá bọt là yếu tố bắt buộc. Trong quá trình nghiên cứu đã lựa chọn 4 chất phá bọt để nghiên cứu: Tween 80, Antifoam, Soybean oil wasted powder và dầu đậu tương với hàm lượng sử dụng như khuyến cáo của nhà sản xuất, kết quả cho thấy các chất này đều có khả năng làm giảm bọt trong đó Tween 80 cho kết quả phá bọt thấp nhất, Soybean oil wasted powder tác dụng tốt xong khi bổ sung vào môi trường nuôi lại tạo vẩn đục gây khó khăn trong việc quan sát hình thái và sự sinh trưởng của hệ sợi nấm,
antifoam với hàm lượng 0,5 ml/lít môi trường và dầu đậu tương với hàm lương 0,5 ml/lít môi trường cho hiệu quả phá bọt triệt để; NCS lựa chọn dầu đậu tương để làm chất phá bọt trong các thí nghiệm tiếp theo vì dầu đậu tương mang lại hiệu quả phá bọt tốt, rẻ tiền, phổ biến.
3.2.2.7. Kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng của giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể
Xây dựng đường cong sinh trưởng của giống trong môi trường dịch thể nhằm xác định được pha sinh trưởng của giống để tiếp tục cấy chuyển sang thể tích nhân giống lớn hơn. Việc xác định giai đoạn sinh trưởng của giống có ý nghĩa quan trọng trong công tác nhân giống, nó góp phần quyết định chất lượng giống nấm đưa vào sản xuất, nuôi trồng nấm, đặc biệt là trong sản xuất lớn.
Sử dụng môi trường CT12; Bố trí thí nghiệm như đã trình bày ở phần 2.3.2.2; kết quả được ghi nhận ở bảng 3.26 sau:
Bảng 3.26. Sự sinh của giống Đầu khỉ trung gian cấp 2 trong môi trường CT12 ở từng thời điểm nuôi
Thời gian (giờ) Chỉ tiêu Sinh khối sợi (g/100ml/) Kích thƣớc khuẩn lạc cầu (mm)
Đặc điểm khuẩn lạc cầu 24 0 <1
Khuẩn lạc cầu nhỏ li ti, trong suốt.
48 0,2 <1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
72 0,45 <1