- Thời gian nuôi sợi sau khi cấy chuyển giống dịch thể sang cơ chất
3.4.4. Kết quả thử hoạt tính sinh học của polysaccharide thu nhận được
3.4.4.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial assay)
Hoạt tính kháng Vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết, quá trình thử được thực hiện trên các phiến vi lượng 96 giếng (96- well microtiter plate) theo phương pháp của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và McKane, L., & Kandel (1996). Các chủng vi sinh vật kiểm định được hoạt hoá và pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland rồi tiến hành thí nghiệm.
Chứng dương tính:
Các phiến thí nghiệm được nuôi trong tủ ấm ở điều kiện 37oC/24 giờ cho vi khuẩn và 30oC/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men.
Kháng sinh sử dụng được pha trong DMSO 10% với nồng độ thích hợp: + Streptomycin 4mM cho vi khuẩn Gr (+) ;
+ Tetracyclin 10mM cho vi khuẩn Gr (-) + Nystatin 4mM cho nấm sợi và nấm men.
Chứng âm tính: vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử. Kết quả thử nghiệm được trình bầy trong bảng 3.42 và 3.43 dưới đây;
Bảng 3.42: Hoạt tính kháng vi khuẩn cuả hai phân đoạn polysaccharide thu được
STT Ký Ký hiệu mẫu Nồng độ mẫu (µg/ml)
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: µg/ml)
Kết quả Vi khuẩn Gr (-) Vi khuẩn Gr (+) E. coli P. aeruginosa B. subtillis S. aureus 1 Mẫu 1 400 (-) (-) (-) (-) Âm tính 2 Mẫu 2 400 (-) (-) (-) (-) Âm tính
Bảng 3.43: Hoạt tính kháng nấm cuả hai phân đoạn polysaccharide thu được
STT Ký hiệu
mẫu
Nồng độ mẫu (µg/ml)
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: µg/ml)
Kết quả Nấm mốc Nấm men A. niger F. oxysporum S. cerevisiae C. albicans 1 Mẫu 1 400 (-) (-) (-) (-) Âm tính 2 Mẫu 2 400 (-) (-) (-) (-) Âm tính
Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cho thấy các phân đoạn polysaccharide không biểu hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ở nồng độ thử 400µg/ml.
3.4.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxicity assay)
Hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxicity assay) được thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm – Viện hóa học các hợp chất tự nhiên; Theo phương pháp của Skehan & CS (1990) và Likhiwitayawuid & CS (1993); Kết quả được trình bầy ở bảng 3.44 dưới đây.
Bảng 3.44: Hoạt tính gây độc tế bào trên 4 dòng ung thư người của hai phân đoạn polysaccharide thu được
Ký hiệu mẫu
Nồng độ mẫu ( g/ml)
Dòng tế bào Cell survival (%) Kết luận
Hep-G2 Lu MCF7 RD DMSO 100,0 0,0 100,0 0,0 100,0 0,0 100,0 0,0 Chứng (+) 5 0,2 0,03 1,5 0,2 0,9 0,1 0,0 0,0 Dương tính Mẫu 1 40 99,2 0,4 92,4 1,4 98,5 0,6 80,6 0,5 Âm tính Mẫu 2 40 98,7 1,2 95,5 0,7 97,9 1,5 98,2 0,9 Âm tính Ghi chú:
+ Dòng Hep - G2 (Human Hepatocellular carcinoma– ung thư gan người) + Dòng Lu (Lung cancer – ung thư phổi)
+ Dòng MCF7 (Human Breast adenocarcinoma – ung thư biểu mô vú) + Dòng RD (Human Rhabdosarcoma - ung thư mô liên kết)
Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên 4 dòng tế bào ung thư gan, ung thư phổi, ung thư biểu mô vú, ung thư mô liên kết, cho thấy các phân đoạn polysaccharide không biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào khi nuôi cấy in vitro; Kết quả này là hoàn toàn phù hợp với các kết quả đã được một số tác giả công bố trước đây. Theo các tác giả Kim và cộng sự,Wong và cộng sự, điều hòa miễn dịch là một trong những cơ chế hoạt động chính mang lại khả năng chống ung thư của H.erinaceus; Các polysaccharide chiết xuất từ nấm Đầu khỉ chủ yếu có khả năng hoạt hoá miễn dịch tế bào, thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào Lympho T và Lympho B giúp tăng cường miễn dịch qua đó ức chế khối u trên động vật thực nghiệm. Các nghiên cứu về khả năng điều hòa miễn dịch và khả năng chống khối u của các polysaccharide chiết xuất từ dịch nuôi hệ sợi nấm H. erinaceus đã được thực hiện trên chuột cho thấy polysaccharide này có khả năng chống lại sự di căn của khối u ở phổi.
Để chứng minh hoạt tính kháng u in vivo của polysaccharide chiết xuất từ nấm Đầu khỉ He1, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn polisaccarid tách chiết được; Đây là phương pháp đánh giá hoạt tính kháng u trung gian giữa in vitro và in vivo, theo tác giả Jong Bin Kim (2005) và Huiyuan Gao & CS, (2007), đang được triển khai thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên. Kết quả được trình bầy trong phần tiếp theo đây.
3.4.4.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành khối u trên thạch mềm của các phân đoạn polisaccarid
Kỹ thuật theo dõi sự hình thành khuẩn lạc là thử nghiệm sự bám dính và hình thành khuẩn lạc trên thạch mềm, đây được coi là kỹ thuật nghiêm ngặt trong kiểm tra sự biến đổi của tế bào. Theo kỹ thuật này, tế bào sau khi xử lý bằng các chất gây ung thư hoặc các chất ức chế ung thư, được nuôi cấy cùng với chất điều chỉnh thích hợp trên môi trường thạch mềm trong 10 - 20 ngày. Tiếp theo giai đoạn nuôi cấy, các khuẩn lạc hình hành có thể được nhuộm rồi phân tích hình thái, hoặc đếm số lượng khuẩn lạc hình thành trên mỗi giếng.
Để thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành khối u trên thạch mềm của các phân đoạn polisaccarid tiến hành thí nghiệm như đã trình bầy trong phần 2.3.5.7; Hoạt tính ức chế hình thành khối u trên thạch được tính lặp lại 3 - 5 lần so sánh % số lượng khuẩn lạc hình thành khối u, kích thước khối u so với đối chứng (DMSO 1%). Kết quả được trình bày ở bảng 3.45.
Bảng 3.45: Hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn polisaccaride
Ký hiệu mẫu
Nồng độ thử mẫu
( g/ml)
Kích thƣớc trung bình của khối u Độ giảm mật độ
khối u so với đối chứng (%)
Đƣờng kính
( l)
% giảm so với đối chứng Đối chứng âm
(DMSO 1%) 22,1 0 100
Mẫu chiết kiềm 40 21,5 2,75 0,21 26,2 0,53
Mẫu chiết nƣớc nóng 40 18,7 15,38 0,92 41,2 1,02
Chứng DMSO 1% Phân đoạn chiết kiềm Phân đoạn chiết nước nóng
Hình 3.49: Hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn polisaccarit
Kết quả kiểm tra cho thấy mặc dù polysacharide tách chiết từ nấm Đầu khỉ He1 không có hoạt tính gây độc tế bào khi nuôi cấy invitro, nhưng khi thử hoạt tính ức chế hình thành khối u 3 chiều trên thạch mềm (anti-tumor promoting assay) in vivo thì lại cho kết quả dương tính rõ rệt. Kết quả trình bầy trong bảng 3.45 và hình 3.48 cho thấy cả hai phân đoạn polysacharide chiết bằng nước nóng và chiết kiềm đều cho kết quả làm giảm kích
thước trung bình của khối u cũng như mật độ khối u so với đối chứng; Trong đó đường kính khối u giảm nhiều nhất là 15,38 0,92%, mật độ khối u giảm 41,2 1,02% so với đối chứng. Kết quả này một lần nữa chứng minh xu thế sử dụng polysacharide tách chiết từ nấm ăn – nấm dược liệu nói chung, nấm Đầu khỉ nói riêng trong việc phòng chống sự hình thành khối u là hoàn toàn khả thi và mang lại nhiều lợi ích trong công tác tăng cường sức khỏe cộng đồng.
Để chứng minh tính an toàn của nấm Đầu khỉ đối với người sử dụng cũng như khả năng bảo vệ phóng xạ của polysacharide tách chiết từ nấm Đầu khỉ, chúng tôi tiếp tục thử trên động vật thử nghiệm, kết quả được trình bày ở phần tiếp theo.
3.4.4.4. Kết quả thử nghiệm in vivo tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm polysaccharide tổng HT1 trên động vật thực nghiệm
Những năm gần đây, các chế phẩm có nguồn gốc tự nhiên được nghiên cứu theo định hướng bảo vệ phóng xạ ngày càng phát triển. Các chế phẩm này có tác dụng làm tăng sức đề kháng của cơ thể sinh vật chống lại các tác nhân gây độc và chống phóng xạ, làm giảm thiểu tác động của bức xạ ion hóa, khôi phục hệ tạo máu, kích thích hệ miễn dịch cơ thể. Các chất này muốn được đưa vào hỗ trợ điều trị cho người, trước hết phải không gây độc cho cơ thể và có tác dụng trong bảo vệ phóng xạ. Trong khuôn khổ của luận án, chúng tôi đã tách chiết được polysaccharide tổng số từ quả thể nấm Đầu khỉ, đặt tên là HT1; HT1 đã được nghiên cứu cơ bản về tính an toàn và hiệu lực bảo vệ phóng xạ trên động vật thử nghiệm tại bộ môn Dược lý, Học viện Quân y - Bộ Quốc phòng. Các kết quả thử nghiệm được trình bầy dưới đây.
a. Kết quả nghiên cứu an toàn của chế phẩm HT1
Thỏ trưởng thành, khỏe mạnh, trọng lượng 2,0 0,2 kg đạt tiêu chuẩn nghiên cứu được nuôi dưỡng theo quy định trong phòng thí nghiệm chuyên dụng dược lý 1 tuần trước khi làm thí nghiệm.
Nhóm chứng: uống dung môi dùng để pha chế phẩm nghiên cứu, liều 1ml/1kg trọng lượng;
Nhóm thử HT1: uống HT1 mức liều 1ml/1kg trọng lượng.
Trong thời gian thí nghiệm, theo dõi chặt chẽ tình trạng chung, trọng lượng cơ thể, kết quả sinh hoá, huyết học, tình trạng tim mạch; So sánh với nhóm chứng. Thời gian theo dõi trong 6 tuần. Lấy máu xét nghiệm các chỉ số sinh hóa, huyết học tại 3 thời điểm: xuất phát điểm (XPĐ), sau 3 tuần, sau 6 tuần nghiên cứu.
a1. Tác dụng của HT1 đối với trọng lượng cơ thể thỏ
Bảng 3.46: Sự thay đổi trọng lượng cơ thể thỏ khi dùng HT1 trong 6 tuần (n = 8)
Nhóm NC Thời điểm Nhóm chứng Nhóm HT1 p2-1 XPĐ x 2,08 2,10 > 0,05 SD 0,20 0,25 Tuần I x 2,12 2,04 > 0,05 SD 0,19 0,23 Tuần II x 2,12 2,06 > 0,05 SD 0,14 0,29 Tuần III x 2,16 2,12 > 0,05 SD 0,15 0,26 Tuần IV x 2,25 2,27 > 0,05 SD 0,10 0,11 Tuần V x 2,43 2,43 > 0,05 SD 0,08 0,13 Tuần VI x 2,52 2,53 > 0,05 SD 0,09 0,13 So sánh VI - I ( % ) tăng 21,15 tăng 20,47 pVI-I < 0,05 < 0,05
So với nhóm chứng, tại tất cả các thời điểm, trọng lượng cơ thể của nhóm thuốc thử biến đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng từng nhóm chứng, nhóm thử, trọng lượng cơ thể thỏ ở tuần thứ 6 so với tuần thứ nhất sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
a2. Tác dụng của HT1 trên điện tim của thỏ khi dùng chế phẩm HT1 6 tuần
Bảng 3.47: Sự thay đổi tần số tim thỏ (chu kỳ/phút) ở đạo trình DII khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần ( n = 8 )
Nhóm NC Thời điểm Nhóm chứng Nhóm HT1 p2-1 XPĐ x 280,6 276,2 > 0,05 SD 35 32,5 Tuần III x 278,9 275,6 > 0,05 SD 37 36,2 Tuần VI x 280 273,9 > 0,05 SD 32 37 pVI -XPĐ > 0,05 > 0,05
So với nhóm chứng, tại tất cả các thời điểm XPĐ, sau 3 tuần, sau 6 tuần trên các băng điện tim, đọc ở đạo trình DII, biên độ QRS của nhóm thử biến đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng từng nhóm (chứng, thử), tại các thời điểm, sự khác biệt cũng không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05).
Bảng 3.48: Sự thay đổi biên độ sóng điện tim thỏ (mV) ở đạo trình DII khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
Nhóm NC Thời điểm Nhóm chứng Nhóm HT1 p2-1 XPĐ x 3,40 3,42 > 0,05 SD 0,25 0,27 Tuần III x 3,37 3,38 > 0,05 SD 0,36 0,30 Tuần VI x 3,40 3,40 > 0,05 SD 0,27 0,25 pVI -XPĐ > 0,05 > 0,05
So với nhóm chứng, tại tất cả các thời điểm XPĐ, sau 3 tuần, sau 6 tuần trên các băng điện tim, đọc ở đạo trình DII, biên độ QRS của nhóm thử biến đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng từng nhóm (chứng, thử), tại các thời điểm, sự khác biệt cũng không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05).
Bảng 3.49: Sự xuất hiện sóng điện tim bệnh lý thỏ ở đạo trình DII khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
Nhóm NC
Thời điểm Nhóm chứng Nhóm HT1
XPĐ Không Không
Tuần III Không Không Tuần VI Không Không
Sau 6 tuần thí nghiệm, không thấy xuất hiện các sóng bệnh lý trên điện tim đồ thỏ các sóng bệnh lý trên điện tim đồ thỏ ở đạo trình DII ở cả 2 nhóm nghiên cứu tại tất cả các thời điểm nghiên cứu.
Như vậy, kết quả từ bảng 3.47, 3.48, 3.49 cho thấy chế phẩm polysaccharide tách chiết từ nấm Đầu khỉ không có tác dụng xấu đến sự hoạt động của tim thỏ thử nghiệm.
a3. Tác dụng của HT1 đến một số chỉ số huyết học trên thỏ khi dùng HT1 6 tuần
Bảng 3.50: Sự thay đổi số lượng hồng cầu ( 1012/l) ở thỏ khi dựng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) Nhóm NC Thời điểm Nhóm chứng Nhóm HT1 p2-1 XPĐ x 5,35 5,25 > 0,05 SD 0,34 0,22 Tuần III x 5,31 5,14 > 0,05 SD 0,27 0,16 Tuần VI x 5,25 5,16 > 0,05 SD 0,34 0,19 pVI-I > 0,05 > 0,05
So với nhóm chứng, tại tất cả các thời điểm, số lượng hồng cầu của nhóm thuốc thử biến đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng từng nhóm (chứng, thử), số lượng hồng cầu thỏ ở tuần thứ 6 so với tuần thứ nhất sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Bảng 3.51: Sự thay đổi hàm lượng hemoglobin (g/l) ở thỏ khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) Nhóm NC Thời điểm Nhóm chứng Nhóm HT1 p2-1 XPĐ x 118,87 115,00 > 0,05 SD 8,69 7,53 Tuần III x 116,62 116,33 > 0,05 SD 6,91 4,39 Tuần VI x 119,00 116,89 > 0,05 SD 9,80 4,99 pVI-I > 0,05 > 0,05
So với nhóm chứng, tại tất cả các thời điểm, hàm lượng Hemoglobin của nhóm thử biến đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng từng nhóm (chứng, thử), hàm lượng Hemoglobin của thỏ ở tuần thứ 6 so với tuần thứ nhất sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Bảng 3.52: Sự thay đổi số lượng bạch cầu ( 109/l) ở thỏ khi dựng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
So với nhóm chứng, tại tất cả các thời điểm, số lượng bạch cầu của nhóm thử biến đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng từng nhóm (chứng, thử), số lượng bạch cầu của thỏ ở tuần thứ 6 so với tuần thứ nhất sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05).
Bảng 3.53: Sự thay đổi số lượng tiểu cầu ( 109/l) ở thỏ khi dựng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) Nhóm NC Thời điểm Nhóm chứng Nhóm HT1 p2-1 XPĐ x 397,00 411,67 > 0,05 SD 38,93 20,66 Tuần III x 402,25 413,00 > 0,05 SD 17,20 19,70 Tuần VI x 405,75 415,00 > 0,05 SD 5,31 12,05 pVI-I > 0,05 > 0,05
So với nhóm chứng, tại tất cả các thời điểm, số lượng tiểu cầu của nhóm thuốc thử biến đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng từng nhóm (chứng, thử), số lượng tiểu cầu của thỏ ở tuần thứ 6 so với tuần thứ nhất sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Nhóm NC Thời điểm Nhóm chứng Nhóm HT1 p2-1 XPĐ x 8,20 9,22 > 0,05 SD 1,49 3,34 Tuần III x 8,32 9,08 > 0,05 SD 1,18 0,90 Tuần VI x 8,45 8,51 > 0,05 SD 0,43 0,69 pVI-I > 0,05 > 0,05
a4. Tác dụng của HT1 đối với hoạt độ enzym SGOT, SGPT của thỏ
Bảng 3.54: Sự thay đổi hoạt độ enzym SGOT của thỏ khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) Nhóm NC Thời điểm Nhóm chứng Nhóm HT1 p2-1 XPĐ x 74,64 67,98 > 0,05 SD 9,29 11,86 Tuần III x 76,4 77,44 > 0,05 SD 10,49 12,71 Tuần VI x 76,91 75,3 > 0,05 SD 10,65 10,49 pVI-I > 0,05 > 0,05
So với nhóm chứng, tại tất cả các thời điểm, hoạt độ enzym SGOT của nhóm thuốc thử biến đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng từng nhóm (chứng, thử), hoạt độ enzym SGOT của thỏ ở tuần thứ 6 so với tuần thứ nhất sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Bảng 3.55: Sự thay đổi hoạt độ enzym SGPT của thỏ khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
Nhóm NC Thời điểm Nhóm chứng Nhóm HT1 p2-1 XPĐ x 89 93,76 > 0,05 SD 14,65 17,16 Tuần III x 88,47 81,65 > 0,05 SD 9,36 18,97 Tuần VI x 90,5 95,05 > 0,05 SD 14,32 15,08 pVI-I > 0,05 > 0,05
So với nhóm chứng, tại tất cả các thời điểm, hoạt độ enzym SGPTcủa nhóm thuốc thử biến đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng từng nhóm (chứng, thử), hoạt độ enzym SGPT của thỏ ở tuần thứ 6 so với tuần thứ nhất sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).