- Tính chất hóa học của β glucan
1.2.6.Một số phương pháp được sử dụng để tách polysaccharide từ quả thể và hệ sợi nấm dược liệu
nấm dược liệu
1.2.6.1. Phương pháp tách chiết trong cồn
a. Phương pháp của Mizuno (1999) [55] + Bước 1: sấy khô nguyên liệu
+ Bước 2: chiết trong etanol nóng để loại những chất có trọng lượng phân tử thấp + Bước 3: tách phần cặn sau chiết, tiếp tục chiết trong nước nóng 100oC trong 3 giờ + Bước 4: chiết trong kiềm NaOH 5%, nhiệt độ 80oC trong 6 giờ
+ Bước 5: bổ sung axit oxalat 1%, nhiệt độ 100oC trong 6 giờ
Sự thu nhận polysaccaride ở các bước tiếp theo được tiến hành bởi sự kết hợp các kỹ thuật: kết tủa phân đoạn, kết tủa trong axit acetic, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực.
b. Phương pháp của Yap và Ng (2001): β – glucan từ Nấm Hương (Lentinula edodes) được tách bằng cách kết tủa trong cồn etanol và đông khô bằng nito lỏng: β - glucan từ nấm Hương Lentinus edodes được tách thông qua sự kết tủa bằng etanol và đông khô bằng nitơ lỏng. Khi tinh chế dùng một cột phân tích cacbonhydrat, cho độ tinh khiết là 87,5%. Về mặt thương mại, phương pháp này tốn ít thời gian, hiệu quả hơn và giá thành thấp hơn so với phương pháp của Mizuno [44].
- Elaine R. Carbonero và cs, (2006) cũng đã công bố một quy trình chi tiết để chiết β - glucan từ quả thể của 2 chủng nấm sò: Pleurotus eryngii và P. ostreatus vẫn dựa trên nguyên tắc chung như các tác giả trên [30].
1.2.6.2. Phương pháp tách chiết trong nước nóng
Phương pháp tách, chiết polysaccaride từ quả thể hoặc sinh khối nấm Maitake để làm thuốc hỗ trợ chống ung thư bao gồm các bước chiết với nước nóng, cô đặc dịch chiết dưới áp suất thấp, kết tủa dịch bằng một dung môi hữu cơ, thẩm tích tủa để loại chất có trọng lượng phân tử thấp và chiết tạp chất bằng dung môi hữu cơ ưa béo để loaị bỏ chúng. (Theo paten của Nhật năm 1968 - Japanese Patent Publication No 16047/1968 và năm 1984- Japanese Patent LOP Publication No 210901/1984). Tuy nhiên, phương pháp này chưa hẳn là phù hợp cho sự chuẩn bị một lượng lớn nguyên liệu dược phẩm và thực phẩm chức năng vì các bước tinh chế quá phức tạp và sản phẩm còn chứa những chất kìm hãm hoạt tính miễn dịch.
Khắc phục hạn chế trong phương pháp tách chiết β - glucan theo Paten của Nhật, người Mỹ đã đưa ra Paten số 5854404 năm 1998 (United State Patent 5854404 - Antitumor substance extracted from Grifola – issued on December 29, 1998), theo đó một chất chống u, bướu có hoạt tính miễn dịch cao, đã được tách, chiết và phân đoạn từ sợi hoặc quả thể Grifola bằng nước nóng, có thể thu được bằng việc bổ sung etanol vào dịch chiết sao cho nồng độ cuối cùng đạt 20 - 60% (tốt nhất là 20 - 50%) thể tích để loại các chất lơ lửng hoặc tạp chất.
1.2.6.3. Phương pháp tách chiết trong kiềm nóng kết hợp với sự hỗ trợ của lò vi sóng và siêu âm [62].
Theo báo cáo của Sheng - Quan Huang và cộng sự (2010) [62] về kết quả tối ưu hóa điều kiện tách chiết Polysaccharide trong nấm Linh chi Ganoderma lucidum bằng kiềm đã chỉ ra rằng quá trình tách chiết có hỗ trợ của lò vi sóng và siêu âm mang lại hiệu quả chiết cao hơn hẳn so với không sử dụng vi sóng và siêu âm. Sheng - Quan Huang đã đưa ra điều kiện thí nghiệm tối ưu cho quá trình tách chiết polysaccharide từ
Ganoderma lucidum trong kiềm như sau: nhiệt độ 60,1ºC, thời gian 77,3 phút, nồng độ NaOH là 5,1% và tỷ lệ dung dịch kiềm 21,4 ml/g cơ chất rắn. Hiệu suất chiết polysaccharide từ Ganoderma lucidum là 8,21% cao gấp 5,0 lần so với chiết trong nước nóng. Quy trình tách gồm các bước sau:
- Tiền xử lý: bột Linh chi khô (độ ẩm 13,26%) được hồi lưu hai lần với ethanol 95% nhiệt độ 70ºC trong một cốc nước nóng trong 3 giờ để bất hoạt các enzym nội sinh và loại bỏ một số chất hòa tan, bao gồm cả đường tự do, axit amin và một số phenol. Các chất chiết xuất được ly tâm (3.000 vòng, 10 phút) theo phương pháp của Li; phần cặn chiết G. lucidum dạng viên được hút chân không sấy khô ở 60ºC trong 24 giờ.
- Chiết trong nước nóng có sự trợ giúp của sóng siêu âm và vi sóng: phần b ã G. lucidum sau chiết ethanol khô được hòa vào nước sau đó dùng sóng siêu âm tác động để tăng hiệu quả chiết. Việc khai thác siêu âm được thực hiện trong 60 phút ở nhiệt độ 50ºC; tiếp tục xử lý mẫu trong lò vi sóng ở chế độ 350 W trong 10 phút. Phần bã không hòa tan được tách ra bằng cách ly tâm (5000 vòng, 15 phút) và sấy khô chân không ở 60ºC trong 20 giờ để có được phần bột không tan (độ ẩm 12,26%) tiếp đưa vào tách trong kiềm. Phần dịch chiết được xử lý theo phương pháp của Li để có được những polysaccharide thô hòa tan trong nước.
- Tách trong Alkaline: các dư lượng khô của G. lucidum sau chiết nước nóng tiếp tục được chiết trong dung dịch NaOH 5,1% để trích xuất các polysaccharide hòa tan trong kiềm. Phần dịch sau chiết xuất được ly tâm (3000 vòng, 10 phút) thu phần
chất lỏng. Chất lỏng sau chiết được đưa vào thiết bị bay hơi quay ở 60o
C trong 30 phút cuối cùng đông khô để có được những polysaccharide thô hòa tan trong kiềm.
1.2.6.4. Phương pháp tách chiết trong nước nóng kết hợp với sự hỗ trợ của lò vi sóng và siêu âm [61, 69].
Theo tác giả Yilin M. các polysaccharide từ Hericium erinaceus có thể được chiết xuất bằng cách kết hợp ba phương pháp: chiết bằng nước nóng, chiết bằng siêu âm và chiết dưới tác dụng của lò vi sóng. Phương pháp chiết bằng lò vi sóng được đánh giá là có hiệu quả chiết cao, thời gian chiết nhanh, tiết kiệm vật liệu chiết, tiết kiệm năng lượng và thân thiện với môi trường; Dưới tác động trực tiếp của bước sóng ngắn trong lò vi sóng sẽ tác động lên vật liệu chiết, do đó nhiệt độ vật liệu được tăng lên một cách nhanh chóng, độ hòa tan của chất mục tiêu trong môi trường được tăng lên, chất lượng chất chiết ổn định. Tốc độ làm nóng vật liệu bằng lò vi sóng cao, thời gian gia nhiệt vật liệu là ngắn, sau đó quá trình chiết sẽ tiếp tục được hoàn thành ở nhiệt độ thấp, do đó các thành phần chức năng của polysaccharide có thể được bảo vệ một cách hiệu quả. Phương pháp chiết bằng nước nóng và phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm là phương thức truyền thống được sử dụng để chiết hầu hết các hợp chất trong nấm lớn, các thông số vận hành được tối ưu hóa, tốc độ và năng suất khai thác được đảm bảo. Quá trình chiết polysaccharide bằng nước nóng kết hợp tác động của lò vi sóng và siêu âm sẽ mang lại hiệu quả cao hơn khi sử dụng đơn lẻ từng phương pháp; Bao gồm các bước sau:
Bước 1: Tiền xử lý vật liệu
Quả thể H. erinaceus khô được nghiền mịn, đem cân, ngâm trong nước tỷ lệ 15 - 25 theo trọng trong 4 giờ trước khi đem chiết.
Bước 2: Chiết
- Khai thác lò vi sóng: lấy hỗn hợp đã xử lý ở bước 1 đưa vào lò vi sóng, điều chỉnh công suất của máy phát điện lò vi sóng 600 – 800 trong 6 - 10 phút, đưa hỗn dịch ra để tách rắn - lỏng, loại bỏ các chất rắn còn lại sau khi thu dịch chiết (dịch chiết I);
- Chiết nước nóng: lấy hỗn hợp đã xử lý ở bước 1 gia nhiệt đến 80 – 90oC, duy trì nhiệt trong vòng 2 - 8 giờ, lọc để thu hỗn hợp chất lỏng (dịch chiết II);
- Khai thác siêu âm: lấy hỗn hợp đã xử lý ở bước 1 gia nhiệt đến 40°C, sử lý bằng siêu âm trong 40 - 60 phút, điều chỉnh pH = 7 5, lọc thu dịch lỏng (dịch chiết III);
Bước 3: trộn 3 dịch chiết (I, II, III) thu được ở 3 cách chiết, đưa hỗn dịch vào thiết bị cô quay áp suất thấp, cho bay hơi ở nhiệt độ 50 – 60oC, thu lấy phần bột sau bay hơi.
Bước 4: Chiết ethanol
Đưa phần cặn sau cô quay vào chiết tiếp bằng ethanol 80 - 90% với tỷ lệ 1:2 để hòa tan polysaccharide kết tủa trong phần bột sau cô quay;
Bước 5: Ly tâm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đem toàn bộ phần hỗn dịch chiết trong ethanol vào thiết bị làm lạnh để giảm nhiệt độ dịch chiết xuống 4o
C trong 18 - 30 giờ, sau đó đưa đi ly tâm ở 2500 – 4000 vòng/phút, ly tâm trong 20 - 30 phút, thu thập polysaccharide bằng cách lấy phần cặn ở ống ly tâm.
Bước 6: Sấy khô
Các polysaccharide thu nhận được đem sấy chân không ở 50 - 70°C đến khối lượng không đổi.
Như vậy, nấm Đầu khỉ là loại nấm dược liệu rất có tiềm năng với giá trị dinh dưỡng và dược liệu cao, chính vì vậy nó đã được nghiên nhiều về công nghệ nhân giống, quy trình nuôi trồng, quy trình tách chiết các chất có hoạt tính… cả ở trong nước lẫn trên thế giới. Tuy nhiên, tại Việt Nam quy trình nhân giống và nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể chưa được nghiên cứu một cách chi tiết từ quy mô nhỏ đến quy mô sản xuất lớn; Chính vì thế Luận án của tôi nhắm vào các nội dung nghiên cứu hoàn thiện qui trình nhân giống và sử dụng giống nấm dạng dịch thể để nuôi trồng nấm Đầu khỉ; Sản phẩm nấm thu được sẽ được sử dụng để tách chiết polysaccharide theo phương pháp chiết nước nóng và chiết kiềm. Kết quả của Luận án nhằm góp phần khai thác hiệu quả hơn nữa các tiềm năng sử dụng nấm ăn – nấm dược liệu nói chung và nấm Đầu khỉ nói riêng.