IV. ĐỀ XUẤT KIẾN NGHỊ:
2.2.4.Phương pháp xử lý đột biến nấm sợi Monascus[59]
S ắc kí bản mỏng (TLC) làm ột kĩ thuật sắc kí được dùng để tách các chất trong hỗn hợp Phương pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất
2.2.4.Phương pháp xử lý đột biến nấm sợi Monascus[59]
Phương pháp kết hợp với tài liệu và kinh nghiệm do phía đối tác là Viện Công nghệ Thành Đô, Tứ Xuyên cung cấp và hướng dẫn thực hiện.
92
2.2.4.1.Xử lý đột biến bằng cách chiếu tia tử ngoại
Chủng bố mẹ nuôi cấy trên môi trường PDA 3-5 ngày, thu bào tử bổ sung vào nước cất đạt nồng độ 106 bào tử/ml. Lấy 1ml dịch bào tử huyền phù bổ sung vào đĩa peptri đường kính 20cm chứa môi trường PDA, dàn đềụ Sử dụng đèn cực tím 15W chiếu vào đĩa thạch trong các khoảng thời gian khác nhaụ Thu bào tử, rửa lại bằng nước cất 3 lần cấy lại trên môi trường PDA, theo dõi hình thái khuẩn lạc, bào tử, chọn những khuẩn lạc có màu vàng nhạt chọn ra để thử độ ổn định, sau đó lên men xác
định hàm lượng chất mầu và Monacolin tạo thành.
2.2.4.2. Xử lý bằng hoá chất đột biến N-methyl-N’-nitrosoguanidine(NTG)
Chủng bố mẹ Monascus purpureus nuôi cấy trên môi trường PDA 3-5 ngày, nhiệt độ 300C
- Kiểm tra trên kính hiển vi theo dõi hình thái bào tử, đếm số lượng bào tử
bằng buồng đếm.
- Hút 1 ml dung dịch huyền phù có chứa 1x 106 bào tử vào ống Eppendoft loại 2 ml.
- Bổ sung NTG với nồng độ 100-250µg/ml pha trong dung dịch citrate buffer 0.2M, pH=5,5.
- Lắc đều ống eppendoft, giữở nhiệt độ 300C trong thời gian 30 phút.
- Pha loãng bằng nước cất 1000 lần ngay sau khi kết thúc thời gian giữ bào tử
trong dung dịch NTG
- Ly tâm thu bào tử, rửa lại bằng nước cất 3 lần.
- Quan sát sự hình thành và phát triển của khuẩn lạc, bào tử trên môi trường PDA
- Bào tử phát triển trên môi trường PDA sau 3-5 ngày, chọn khuẩn lạc mầu vàng đem thử độ ổn định và lên men tìm chủng có khả năng sinh tổng hợp chất mầu và Monacolin cao nhất. Sinh khối thu nhận được dùng để tách chiết, tinh sạch, phân tích hàm lượng chất mầu và Monacolin bằng phương pháp đo cường độ màu ở bước sóng 370nm, 400nm, 500 nm hoặc bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC). Kiểm tra độc tính citrinin của các chủng đã lựa chọn.