Hàm lượng
KH2PO4 (g/l)
Trọng lượng sinh khối khô
(g/l)
Hàm lượng astaxanthin
(µg/g sinh khối
khơ) (µg/l dịch ni cấy) 0 4,0680 ± 0,0834 469,05 ± 20,34 1908,09 ± 29,61 1 4,4595 ± 0,0544 265,71 ± 5,39 1184,95 ± 15,17 2 4,4850 ± 0,0643 426,91 ± 20,82 1914,67 ± 36,11 3 4,4950 ± 0,0205 335,71 ± 7,11 1509,04 ± 25,10 4 4,7330 ± 0,0438 319,52 ± 4,21 1512,31 ± 33,53 5 4,3540 ± 0,0255 286,67 ± 30,74 1248,15 ± 48,92
Từ kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 bổ sung vào môi trường rỉ
đường nuôi cấy đến hàm lượng astaxanthin thu nhận được, chúng tôi nhận thấy rằng
trọng lượng sinh khối khơ có sự tăng dần ở hàm lượng KH2PO4 từ 0 g/l đến 4 g/l, đạt cao nhất tại hàm lượng KH2PO4 4 g/l (4,7330 g/l), sau đó giảm dần ở nồng độ KH2PO4 5 g/l,
hàm lượng astaxanthin tính trên gam sinh khối khơ và hàm lượng astaxanthin tính trên
thể tích dịch ni cấy cũng có sự tăng giảm giống nhau nhau: ở hàm lượng KH2PO4 1 g/l có sự giảm mạnh hàm lượng astaxanthin so với lô đối chứng, hàm lượng KH2PO4 2 g/l
(1914,67 µg/l ) cho hàm lượng astaxanthin cao xấp xỉ bằng so với lơ đối chứng (1908,09 µg/l), ngược lại ở các hàm lượng KH2PO4 tăng dần từ 3 đến 5 g/l lại cho hàm lượng
59
astaxanthin giảm dần. Giải thích cho điều này có thể là do hàm lượng kali cao gây ức chế cho sự phát triển và sinh trưởng của nấm men. Kali trong rỉ đường có hàm lượng cao nhất so với các nguyên tố khoáng khác, chiếm 0,98 ± 0,17%. Muối kali có nhiều trong rỉ
đường là do muối kali được dùng để bón cho cây mía trong giai đoạn trồng trọt. Vì
vậy khi ta bổ sung thêm muối KH2PO4 vào làm tăng thêm hàm lượng kali vốn đã cao
trong môi trường nuôi cấy, làm ức chế nấm men phát triển. Hơn nữa, theo nghiên cứu của
Ryan và Johnson (2001) báo cáo rằng nồng độ kali cao trong rỉ đường làm giảm sự sản xuất các sản phẩm thứ cấp của nấm men.
Theo nghiên cứu của Bhosale and Gadre (2001) khi nghiên cứu sự thu nhận carotenoid của chủng Rhodotorula glutinis đột biến trên môi trường rỉ đường. Sau khi xử lý rỉ đường và có mơi trường rỉ đường sẵn sàng cho nuôi cấy, tác giả bổ sung vào môi trường nuôi cấy hàm lượng KH2PO4 2 g/l, kết quả hàm lượng carotenoid thu được sau 32 giờ ni cấy là 1,79 mg/l (tính trên thể tích dịch ni cấy), 3,5 mg/g (tính trên gam sinh khối khơ) và hàm lượng sinh khối khô thu được là 12,2 g/l [17]. Hàm lượng KH2PO4 mà tác giả sử dụng tương đồng với hàm lượng KH2PO4 mà chúng tôi khảo sát (2g/l) cho hàm
lượng astaxanthin cao nhất. Tuy nhiên theo kết quả của chúng tôi hàm lượng KH2PO4 2
g/l cho hàm lượng astaxanthin tính trên lít dịch ni cấy tăng rất ít, xấp xỉ bằng với lơ đối
chứng. Vì vậy, việc bổ sung KH2PO4 khơng làm tăng nhiều hàm lượng astaxanthin so với khi không bổ sung KH2PO4 nên các nghiệm thức về sau không cần thiết phải bổ sung KH2PO4 vào môi trường rỉ đường nuôi cấy.
Kết luận lại sau tất cả các nghiệm thức đã khảo sát, môi trường rỉ đường với các yếu tố thích hợp như sau: hàm lượng đường tổng rỉ đường 25 g/l, hàm lượng urea 0,5 g/l
và hàm lượng MgSO4 3 g/l. Môi trường với các yếu tố thích hợp này sẽ dùng để thực hiện tiếp thí nghiệm tiếp theo là dựng đường cong tăng trưởng của chủng nấm men
Rhodosporidium sp. trên môi trường rỉ đường đã khảo sát các yếu tố thích hợp.
3.1.3.2 So sánh sự sinh trưởng và sinh tổng hợp/ tích lũy astaxanthin của
Rhodosporidium sp. trên môi trường Hansen biến đổi và môi trường rỉ đường bổ
sung dinh dưỡng
Để đánh giá sự tăng trưởng và tích lũy astaxanthin của Rhodosporidium sp. trên
60
Đường cong sinh trưởng của Rhodosporidium sp. trên hai môi trường: Hansen biến
đổi và rỉ đường bổ sung dinh dưỡng
Kết quả khảo sát đường cong tăng trưởng của Rhodosporidium sp. trên hai môi
trường được thể hiện ở đồ thị hình 3.14. Sự tăng trưởng của Rhodosporidium sp. trên hai môi trường này là tương tự nhau: 6 giờ đầu là pha tiềm tàng, từ 7 giờ đến 12 giờ tiếp theo là pha tăng trưởng, từ 13 giờ đến khoảng 80 giờ tiếp theo là pha ổn định, sau đó là pha suy tàn. Đặc biệt, mật độ tế bào có trong mơi trường rỉ đường bổ sung dinh dưỡng cao hơn so với môi trường Hansen biến đổi. Kết quả này một lần nữa khẳng định thế mạnh
của môi trường rỉ đường trong nền công nghiệp sản xuất sinh khối nấm men dùng cho thực phẩm.
Hình 3.14: Đồ thị đường cong tăng trưởng của Rhodosporidium sp. trên môi trường Hansen biến đổi và môi trường rỉ đường bổ sung dinh dưỡng.
Hình thái khuẩn lạc và sự sinh tổng hợp/tích lũy astaxanthin ở Rhodosporidium sp.
Chúng tôi tiến hành cấy chủng nấm men này trên 2 môi trường Hansen biến đổi và rỉ đường bổ sung dinh dưỡng để quan sát đặc điểm hình thái của chúng với mục đích theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc của chúng khi mọc trên môi trường rỉ đường, xem xét chúng có phát triển bình thường như khi mọc trên mơi trường Hansen khơng (hình 3.15 và bảng 3.12 )
61
Hình 3.15: Hình ảnh khuẩn lạc Rhodosporidium sp. trên môi trường Hansen biến đổi
(A) và môi trường rỉ đường bổ sung dinh dưỡng (B) sau 7 ngày nuôi cấy
Bảng 3.12: So sánh đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng nấm men
Rhodosporidium sp. trên 2 môi trường Hansen biến đổi và rỉ đường bổ sung dinh
dưỡng
Đặc điểm Trên môi trường
Hansen
Trên môi trường rỉ đường
Thời gian khuẩn lạc bắt đầu mọc Sau 2 ngày cấy Sau 1 ngày cấy Hình dạng tế bào Hình cầu, lồi, rìa
trịn
Hình cầu, lồi, rìa
hơi nhăn
Màu sắc Hồng cam Đỏ nâu Kích thước trung bình khuẩn lạc (đường
kính khuẩn lạc) 0,2-0,5cm 0,8-1,2cm
Từ kết quả quan sát đặc điểm hình thái của nấm men Rhodosporidium sp. trên 2
môi trường khác nhau: rỉ đường và Hansen, chúng tôi nhận thấy rằng cùng một thời gian
nuôi cấy nhưng trên môi trường rỉ đường khuẩn lạc phát triển nhanh chóng và có kích
thước lớn hơn (gấp 2 lần kích thước trên mơi trường Hansen), cho hình dạng tế bào giống
nhau, khơng có gì bất thường. Có sự khác nhau về màu sắc khuẩn lạc, trên môi trường rỉ
đường cho màu sắc khuẩn lạc là màu đỏ nâu, cịn trên mơi trường Hansen cho màu sắc
62
Hình 3.16: Sinh khối khơ astaxanthin thu được khi nuôi cấy trên môi trường Hansen biến đổi (A) và môi trường rỉ đường bổ sung dinh dưỡng (B)
Ta thấy rõ có sự khác nhau về màu sắc giữa sinh khối astaxanthin trên 2 môi
trường. Màu sắc sinh khối cũng tương ứng với màu sắc khuẩn lạc (hình 315). Sinh khối astaxanthin trên mơi trường rỉ đường cho màu đỏ đậm cịn sinh khối astaxanthin trên mơi trường Hansen cho màu vàng cam (Hình 3.16).
Bảng 3.13: Hàm lượng astaxanthin thu được của chủng nấm men Rhodosporidium sp. trên 2 môi trường Hansen biến đổi và rỉ đường bổ sung dinh dưỡng vào pha suy
tàn Mơi trường Hàm lượng astaxanthin (µg/g sinh khối khơ) (µg/l dịch nuôi cấy) Hansen 194,83 ± 0,77 1158,42 ± 75,96 Rỉ đường 404,68 ± 1,57 1842,81 ± 61,78
Từ kết quả khảo sát hàm lượng astaxanthin tính trên thể tích dịch ni cây khi
nuôi trên 2 môi trường: môi trường Hansen biến đổi và môi trường rỉ đường bổ sung dinh dưỡng với các yếu tố thích hợp, đều thu vào đầu pha suy tàn là giai đoạn cho hàm lượng
astaxanthin lớn nhất, chúng tôi nhận thấy hàm lượng astaxanthin thu được trên môi
63
+ Hàm lượng astaxanthin tính trên gam sinh khối khô: môi trường rỉ đường đã
khảo sát các yếu tố thích hợp cao gấp 2 lần môi trường Hansen đã tối ưu.
+ Hàm lượng astaxanthin tính trên thể tích dịch ni cấy: trên mơi trường rỉ đường
cao gấp 1,59 lần môi trường Hansen đã tối ưu.
Vì vậy, chúng ta kết luận rằng môi trường rỉ đường bổ sung dinh dưỡng cho hàm
lượng astaxanthin cao hơn so với môi trường Hansen biến đổi. Xét về giá thành kinh tế, môi trường rỉ đường cho giá thành thấp hơn so với môi trường Hansen bởi rỉ đường rất
dồi dào trong sản xuất công nghiệp với giá thành rẻ (giá dao động trên thị trường là 3.000
đồng/lít), nguồn đạm là urea có giá thành vừa phải, thêm vào đó hàm lượng urea dùng trong môi trường rỉ đường đã khảo sát dùng với hàm lượng thấp (0,5 g/l). Hiệp hội phân
bón Việt Nam đã công bố giá sàn đối với các loại phân bón urea, theo đó, các doanh
nghiệp thống nhất mức giá bán là 2.600-2.610 đồng/kg (chưa tính thuế giá trị gia tăng).
Do đó, ni cấy chủng nấm men Rhodosporidium sp. trên môi trường rỉ đường để thu
nhận astaxanthin có tiềm năng có thể áp dụng vào quy mô sản xuất astaxanthin công nghiệp.
3.1.3.2 Khảo sát điều kiện nhân giống và nuôi cấy Rhodosporidium sp. ở quy mơ pilot (2 lít)
Sau khi tìm được điều kiện thích hợp để ni cấy Rhodosporidium sp. trên môi
trường rỉ đường, cần tìm điều kiện nhân giống thích hợp để nâng quy mô nuôi cấy
Rhodosporidium sp. lên những quy mô lớn hơn. Với điều kiện phịng thí nghiệm của
mình, quy mơ pilot mà chúng tơi hướng đến có dung tích 2 lít.
Để có thể nhân giống và ni cấy thành công chúng tôi cần thực hiện một số bước
sau:
- Hoạt hóa giống trên môi trường Hansen biến đổi đến khi sinh khối có màu đỏ (khoảng 3 ngày, tùy theo độ mạnh yếu của giống ban đầu)
- Nhân giống bậc 1 trên môi trường rỉ đường bổ sung dinh dưỡng bằng cách cấy giống đã hoạt hóa trên mơi trường Hansen biến đồi vào môi trường rỉ đường bổ
sung dinh dưỡng sao cho giá trị OD610 ban đầu nằm trong khoảng từ 0,08 – 0,1,
64
điểm này, lượng sinh khối hầu như không tăng nhiều nhưng cũng đã bắt đầu tích
lũy astaxanthin
- Chuẩn bị hệ thống ni cấy sục khí quy mơ lớn, đảm bảo vơ trùng
Hệ thống đã được thiết kế và hoạt động tốt. Khi khí được đưa từ máy bơm khí vào
ống dẫn, được cản bụi và một số thành phần nhờ bông không thấm, tiếp tục sát khuẩn qua
dung dịch KMnO4 N/50 và được bẫy tại một erlen - không để dung dịch KMnO4 đi vào thiết bị, được lọc ở syring lọc khí với kích thước lỗ 0,2 µm rồi mới đưa vào thiết bị.
Lượng khí cho vào hệ thống đủ mạnh để làm xáo trộn dung dịch tạo điều kiện vi sinh vật
có thể phát triển tốt ở điều kiện hiếu khí. Phần hút dịch hoạt động tốt, dịch được hút qua một bình hút dịch 2 ml bằng pitong, lượng dịch này sẽ dùng để khảo sát đường cong tăng
trưởng.
Hình 3.17: Ảnh chụp hệ thống ni cấy sục khí quy mơ 2 lít tại PTN. Sinh Hóa, Trường
Đại học Khoa học Tự nhiên
- Cấy giống bậc 1 vào môi trường rỉ đường bổ sung dinh dưỡng để lên men tạo nhiều sinh khối ở quy mô 2 lít. Cần khảo sát lượng giống bậc 1 thích hợp để bổ sung vào.
65
Nhân giống bậc 1 (200 ml) trên môi trường rỉ đường bổ sung dinh dưỡng
Hình 3.18: Đồ thị đường cong tăng trưởng của Rhodosporidium sp. trên môi trường rỉ
đường bổ sung dinh dưỡng – Môi trường nhân giống bậc 1 với giá trị OD610 ban đầu nằm trong khoảng từ 0,08 – 0,1, sau khi Rhodosporidium sp. được hoạt hóa 3 ngày trên
môi trường Hansen biến đổi
Đồ thị đường cong tăng trưởng khi tăng sinh bậc 1 của chủng Rhodosporidium sp. trên môi trường rỉ đường bổ sung dinh dưỡng cho thấy các giai đoạn sinh trưởng khác
nhau của chủng nấm men này trên môi trường rỉ đường như sau: pha tiềm tàng trong
khoảng 6 giờ đầu, pha tăng trưởng hàm mũ vào khoảng giờ thứ 8 đến giờ thứ 30, pha ổn định từ giờ thứ 32 đến giờ thứ 82, pha suy tàn từ giờ thứ 84 trở về sau.
Chúng tôi quyết định chọn thời điểm giờ thứ 30 – thời gian cuối pha lũy thừa để bổ sung giống tăng sinh bậc 1 vào hệ lên men (2 l) theo các tỷ lệ giống 5 %, 7,5 %, 10 %
để khảo sát đường cong tăng trưởng, trọng lượng sinh khối khô và hàm lượng
66
Khảo sát tỉ lệ bổ sung giống bậc 1 phù hợp cho q trình ni cấy Rhodosporidium sp.
ở quy mơ 2 lít
Hình 3.19: Đồ thị đường cong tăng trưởng của Rhodosporidium sp. trên môi trường rỉ
đường bổ sung dinh dưỡng – Môi trường nuôi cấy thu sinh khối ly trích astaxanthin với lượng giống bậc 1 được bổ sung chiếm từ 5%, 7,5% và 10% thể tích ni, sau khi Rhodosporidium sp. được nhân giống bậc 1 đến cuối giai đoạn tăng trưởng (log phase)
đầu giai đoạn ổn định (stationary phase)
Nếu chỉ dựa vào đường cong sinh trưởng (đồ thị hình 3.19) sẽ khơng thể kết luận
được tỉ lệ bổ sung giống bậc 1 thích hợp. Do đó cần phải dựa vào kết quả trọng lượng
67
Bảng 3.14: Hàm lượng sinh khối khô và astaxanthin thu nhận được của chủng nấm
men Rhodosporidium sp. trên môi trường rỉ đường với các tỷ lệ giống vào đầu pha
suy tàn
Phần trăm giống bổ sung vào môi
trường (%)
Mật độ giống
ban đầu
(tế bào/ml)
Trọng lượng sinh khối khơ
thu được (g/l) Hàm lượng astaxanthin (µg/g sinh khối khơ) (µg/l dịch ni cấy) 5 3,7.106 4,0540 283,38 ± 15,34 1394,89 ± 75,50 7,5 5,6.106 4,9223 327,86 ± 10,93 1613,81 ± 53,82 10 7,9.106 6,1696 374,29 ± 7,22 2309,17 ± 44,54
Hình 3.20: Biểu đồ đánh giá hàm lượng astaxanthin thu được khi nuôi cấy nấm men trên
môi trường rỉ đường bổ sung dinh dưỡng ở những tỉ lệ bổ sung giống bậc 1 khác nhau.
Các chữ cái ở đỉnh cột biểu đồ biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với n = 3, p < 0,05
Dựa vào kết quả trên, chúng tôi thấy rằng khi nuôi cấy chủng nấm men
68
lượng astaxanthin và khối lượng sinh khối khô tỷ lệ giống 5 % và 7,5 % không tăng
mạnh, trong khi hàm lượng astaxanthin và khối lượng sinh khối khô ở tỷ lệ giống 10 %
tăng đáng kể.
Do vậy, chúng tôi quyết định sẽ chọn phương pháp nuôi cấy chủng nấm men hồng
Rhodosporidium sp. trên môi trường rỉ đường bằng hệ thống lên men quy mô pilot (2 l)
với tỷ lệ giống 10 % và thời gian thu nhận sinh khối khô nấm men Rhpdosporidium sp. là 74 giờ .
3.2 Nghiên cứu các điều kiện để nuôi cấy vi tảo Haematococcus pluvialis sinh tổng hợp nhiều astaxanthin ở điều kiện phịng thí nghiệm
3.2.1 Đường cong tăng trưởng 3.2.1.1 Đường cong sinh khối khô 3.2.1.1 Đường cong sinh khối khô
Dựa vào các giá trị OD610 nm0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 và trọng lượng sinh khối khô của tế bào tảo tương ứngđể tính được trọng lượng sinh khối khô trong 1 ml môi trường
(mg/ml). Kết quả tương quan tuyến tính giữa giá trị OD610 nm và trọng lượng sinh khối khô (mg/ml) trong môi trường F2, RM, BG11 được thể hiện trong đồ thị 3.21.
Hình 3.21: Đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD610nm và trọng lượng sinh khối khô (mg/ml)
69
Dựa vào đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD610 nm và trọng lượng sinh khối khô dựng được đường cong sinh khối khô theo ngày của 3 môi trường như đồ thị hình 3.21.
Hình 3.22: Đồ thị đường cong sinh khối khô theo ngày ở 3 môi trường
Từ kết quả trên có thể thấy được trọng lượng sinh khối khô thu được trong môi
trường BG11 là nhiều nhất. Thành phần môi trường BG11 và môi trường RM, F2 khơng
khác nhau nhiều nhưng có sự chênh lệch về nồng độ khá lớn, đặc biệt là nồng độ nitơ
trong môi trường BG11 cao gấp 5 lần nồng độ nitơ trong môi trường RM và gấp 200 lần trong môi trường F2 mà nitơ là một thành phần quan trọng trong tế bào vì ngun tố này
có mặt trong tất cả protein, DNA, RNA, thành tế bào và diệp lục tốnên sẽ ảnh hưởng nhiều đến sự sinh trưởng của vi tảo.
Từ kết quả này môi trường BG11 được chọn là môi trường dùng để tăng sinh khối phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.