Hiệu suất PL 1(%) Hiệu suất PL 2 (%) Hiệu suất PL 3 (%) Hiệu suất PL 4 (%)
75,26 6,56 62,13 7,25
Dựa vào bảng 3.25 nhận thấy hiệu suất tách chiết giữa vách tế bào men bia và tế bào men bánh mì có chênh lệch nhiều cụ thể polysaccharide 1 là 75,26 %,
polysaccharide 3 thu được là 62,13 % .
Theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Muôn từ 1000 g bã men bia tươi (được lấy từ cơng ty bia sài gịn) trong 300 ml DMSO thì thu được 2,556 g chế phẩm giàu β-glucan
[6], vì tác giả khơng đề cập đến độ ẩm bã men bia tươi nên theo kết quả của chúng tôi đo
được độ ẩm bã men bia tươi được lấy từ cơng ty bia sài gịn là khoảng 80%, như vậy hiệu
suất tách polysaccharide của tác giả Nguyễn Văn Muôn từ 1000 g bã men tươi tác giả thu
được chế phẩm giảu β-glucan có hiệu suất là 1,278 % thấp hơn chúng tôi (5,86%).
Cũng theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Muôn từ 100g men bánh mì dạng khơ trong 400 ml DMSO thì thu được 0,476 g chế phẩm giàu β-glucan vậy hiệu suất là 0,476 % thấp hơn chúng tôi (7,25%)
d. Xác đinh sự hiện diện của β-glucan trong mẫu polysaccharide
Phổ H1NMR của polysaccharide từ bã men bia
+ Polysaccharide 1 (PL1) từ bã men bia
133
Trong hình 3.82, khi chạy phổ cộng hưởng hạt nhân 1H NMR β-glucan tách chiết, chúng tôi thấy được mẫu tách chiết có tất cả các peak biểu trưng cho β-glucan tại 3,46 (2H), 3.7 (1H),4,72 (2H), 4.79 (dung mơi D2O hịa tan mẫu), ppm. Khi so sánh với phổ cộng hưởng từ hạt nhân của Harry E.Ensley và các cộng sự, ta có thể thấy sự tương đồng về các peak β-glucan.
Hình 3.83 Phổ cộng hưởng hạt nhân 1H NMR của Polysaccharide 2 men bia
+ Polysaccharide 2 (PL2) từ bã men bia
Hình 3.83 cho ta thấy, khi chạy phổ cộng hưởng hạt nhân 1H NMR của Polysaccharide men bia chúng tơi thấy được mẫu tách chiết có các peak biểu trưng cho β- glucan tại 3,46 (2H), 4,72 (2H), 4.79 (dung mơi D2O hịa tan mẫu), ppm, và mẫu còn nhiều peak khác không phải các peak đặc trưng của β-glucan điều này cho thấy mẫu Polysaccharide vẫn còn nhiều tạp chất.
Phổ H1NMR của polysaccharide từ men bánh mì
134
Hình 3.84 Phổ cộng hưởng hạt nhân 1H NMR của Polysaccharide 3 men bánh mì
Hình 3.84 cho ta thấy, khi chạy phổ cộng hưởng hạt nhân 1H NMR của β-glucan men bánh mì chúng tơi thấy được mẫu tách chiết có các peak biểu trưng cho β-glucan tại 3,46 (2H), 3,7 (1H) ppm, và mẫu cịn nhiều peak khác khơng phải các peak đặc trưng của
β-glucan điều này cho thấy mẫu β-glucan men bánh mì vẫn cịn nhiều tạp chất.
135
Hình 3.85 Phổ cộng hưởng hạt nhân 1H NMR của Polysaccharide 4 men bánh mì
Hình 3.85 cho ta thấy, khi chạy phổ cộng hưởng hạt nhân 1H NMR của Polysaccharide men bánh mì chúng tơi thấy được mẫu tách chiết có các peak biểu trưng
cho β-glucan tại 3,46 (2H), 3,7 (1H), 4,72 (2H), 4.79 (dung môi D2O hòa tan mẫu), ppm, và mẫu còn nhiều peak khác không phải các peak đặc trưng của β-glucan điều này cho thấy mẫu Polysaccharide vẫn còn nhiều tạp chất.
Hiệu suất β-glucan có trong polysaccharide Bảng 3.36: Hiệu suất thu được β-glucan
Mẫu Polysaccharide Glucan tổng số (%w/w) α-glucan (%w/w) β-glucan (%w/w)
Men Bia Polysaccharide 1 46, 74 ± 0,13 2,04 ± 0,04 44,70 ± 0,17
Polysaccharide 2 20,39 ± 0,52 3,35± 0,07 17,04± 0,58
Men Bánh mì Polysaccharide 3 48,67 ± 0,31 2,39 ± 0,016 46,59± 0,31
136
Bảng 3.36 cho chúng ta thấy hiệu suất β-glucan có trong polysaccharide thu được
ở men bia và men bánh mì chênh lệch khơng đáng kể hiệu suất β-glucan có trong
polysaccharide 1 ở men bia là 44,7 % (PL1) và men bánh mì là 46,59 % (PL3) chênh lệch 1,89 %. Tuy nhiên, hiệu suất thu được β-glucan ở polysaccharide 4 men bánh mì là 9,8 % (PL4) thấp hơn men bia (17,04 %, PL2) .
3.4 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung astaxanthin vào thức ăn với việc tăng
cường màu sắc ở cá dĩa đỏ Symphysodon sp. (so sánh với sản phẩm astaxanthin
thương mại)
Bảng 3.37 Điểm số màu sắc của cá dĩa đỏ các nghiệm thức
Nghiệm thức Điểm số Lặp lần 1 Lặp lần 2 Lặp lần 3 Trung bình ± Độ lệch chuẩn ĐC 20,42 20,43 20,6 20,48c ± 0,10 A-CX 26,01 26,27 26,4 26,23b ± 0,20 A-TT 28,04 28,26 28,46 28,25a ± 0,21
Ghi chú: Điểm số của mỗi lần lặp là trung bình cộng của 3 người tham gia đánh giá dựa
vào bảng điểm của quạt so màu.Các chữ cái trên cùng một cột khác nhau là sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0.05)
Kết quả ảnh hưởng astaxanthin lên màu sắc của cá dĩa được đánh giá thông qua điểm số màu sắc thể hiện ở Bảng 3.37. Sau ba tháng thí nghiệm, kết quả cho thấy màu
sắc của cá dĩa đỏ ở các nghiệm thức có sự khác nhau rõ rệt. Dựa vào kết quả về điểm số màu sắc trung bình và phân tích thống kê Anova một yếu tố của Bảng 3.37 thì cá dĩa có màu sắc đậm nhất ở nghiệm thức A-TT với số điểm trung bình là 28,25; kế đến là nghiệm thức A-CX tương ứng với số điểm 26,23; nghiệm thức đối chứng không sử dụng
astaxanthin cho kết quả màu sắc trên da cá dĩa nhạt nhất với 20,48 điểm. Điều này có thể do sản phẩm ly trích từ tảo có nguồn gốc tự nhiên nên tác dụng lên màu cho cá dĩa diễn ra chậm hơn theo một cơ chế tác động nhiều giai đoạn, còn sản phẩm astaxanthin trên thị
trường được tổng hợp bằng con đường hóa học nên có tác động nhanh hơn. Theo đánh
giá cảm quan từ nhóm nghiên cứu, cá dĩa khi được cho ăn thức ăn bổ sung astaxanthin chiết xuất từ tảo có thể lưu giữ màu được lâu hơn sau khi dừng cho ăn thức ăn có bổ sung sắc tố so với cá dĩa được cho ăn thức ăn bổ sung astaxanthin từ thị trường.
137
Mặc dù sự lưu giữ màu sắc trên cá dĩa thí nghiệm chỉ là đánh giá cảm quan của nhóm nghiên cứu, nhưng điều đó cũng cho thấy astaxanthin có nguồn gốc tự nhiên có một ảnh hưởng nhất định và hiệu quả. Điều này đã được Eaton và cộng sự (2016) kiểm
chứng khi tiến hành thí nghiệm về ảnh hưởng của astaxanthin tổng hợp và astaxanthin tự nhiên lên cá Anh Đào Puntius titteya [15]. Thí nghiệm thực hiện trong 12 tuần với hai
liều astaxanthin mỗi loại, 20 và 40 ppm, được bổ sung vào thức ăn. Astaxanthin tự nhiên
được sản xuất bằng phương pháp lên men vi khuẩn Paracoccus carotinifaciens. Khẩu phần ăn có chứa 20 ppm astaxanthin tự nhiên hay tổng hợp làm tăng màu đỏ của vây hậu mơn và phần lưng phía trước cá đực. Trong khi đó, thức ăn đối chứng lại làm giảm màu
đỏ trên cá Anh Đào. Đặc biệt, kết quả nghiên cứu cho thấy chỉ có liều 20 ppm astaxanthin
tự nhiên làm thay đổi màu sắc trên cá cái. Việc bổ sung astaxanthin từ tảo cũng đã được
thực hiện trên một số loài cá khác như cá đuôi kiếm đỏ (Xiphophorus helleri), cá gấm
(Pseudomugil furcatus) và cá vây cứng hoàng ngọc (Cichlasoma myrnae), cường độ màu sắc có ý nghĩa được cải tiến khi khẩu phần ăn chứa 1,5 – 2% giống tảo giàu carotenoid
Spirulina platensis và 1% Haematococcus pluvialis trong 3 tuần [22].
Cá cũng như các loài động vật khác không thể tổng hợp mới carotenoid [22].Màu sắc của chúng chủ yếu dựa vào carotenoid từ thức ăn [42]. Là một carotenoid quan trọng,
astaxanthin được sử dụng rộng rãi như là một sắc tố đỏ hoặc hồng được bổ sung vào thức ăn cho cá nhằm tăng màu đỏ trên da hay cơ thịt cá.Điều này đặc biệt có ý nghĩa quan
trọng với các loài cá cảnh. Một nghiên cứu của Trịnh Thị Lan Chi (2010) về thử nghiệm bổ sung sắc tố astaxanthin và canthaxanthin vào thức ăn cho cá chép Nhật (cá chép Koi –
Cyprinus carpio) nhằm duy trì màu sắc cá cho thấy: Với hàm lượng bổ sung > 25 mg/kg
thức ăn, astaxanthin có tác dụng tích cực trong việc cải thiện màu sắc ở cá chép Nhật, trong đó hàm lượng hiệu quả nhất là 78,22 ± 5,84 mg/kg thức ăn. Định kỳ 3 tháng / lần cho cá ăn thức ăn có bổ sung astaxanthin với hàm lương 78,22 ± 5,84 mg/kg liên tục trong 2 tháng sau đó ngưng 1 tháng rồi lại tiếp tục lặp lại chu kỳ trên. Hoặc cho cá ăn
thức ăn có bổ sung astaxanthin với hàm lượng 80 mg/kg trong 2 tháng, sau đó giảm cịn 51,5 ± 13,86 mg/kg thức ăn để duy trì màu sắc của cá. Tương tự như astaxanthin, với hàm lượng bổ sung > 25 mg/kg, canthaxanthin có tác dụng cải thiện màu sắc của cá chép
138
A.Cá lúc bố trí thí nghiệm
B. Cá NTĐC khi kết thúc thí nghiệm
C. Cá ở NT Astaxanthin tách chiết D. Cá ở NT Astaxanthin trên thị trường
139
3.5 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung b-glucan vào thức ăn với việc tăng cường sức đề kháng ở cá dĩa đỏ
3.5.1 Kết quả ảnh hưởng β-glucan đến số lượng bạch cầu của cá dĩa
Sau 30 ngày cho cá ăn thức ăn có bổ sung β-glucan với các nồng độ khác nhau
0,1%, 0,5% và 1 %, mang cá ở nghiệm thức cho ăn ở nồng độ 1% và 0,5% có màu đỏ tươi và lượng máu nhiều hơn so với nghiệm thức đối chứng do bên trong sợi mạng chứa
nhiều tế bào hồng cầu hơn.
Hình 3.87 Tổng số tế bào bạch cầu sau khi bổ sung β-glucan ở nghiệm thức đối chứng và
3 nghiệm thức bổ sung β-glucan
Kết quả này cũng tương tự như kết quả nghiên cứu của Yang và cộng sự (2014)
khi nghiên cứu ảnh hưởng của β-glucan lên hệ miễn dich của tôm khi cho tôm ăn thức ăn có chứa 0,1% trong vòng 28 ngày, tổng số tế bào trong máu tăng lên so với mẫu đối
chứng (1) [48]. Đồng thời, qua kết quả đếm lượng bạch cầu cũng cho thấy tổng số tế bào bạch cầu trong máu có sự thay đổi so với nghiệm thức đối chứng không bổ sung β-
glucan. Theo kết quả đếm lượng bạch cầu trong hình 3.87, lượng bạch cầu ở nghiệm thức
cho ăn thức ăn có bổ sung 1% β-glucan là cao nhất 3,6×103 tb/ul, cao hơn nhiều so với nghiệm thức đối chứng là 1,55×103 tb/ul. Ở nghiệm thức bổ sung 0,5% β-glucan số lượng bạch cầu tăng 2,98×103 tb/ul và ở nghiệm thức 0,1% β-glucansố lượng bạch cầu là
1,9×103 tb/ul, tăng không đáng kể so với nghiệm thức đối chứng. Bạch cầu có vai trị
140
Điều này cho thấy β-glucan có tác động làm tăng số lượng bạch cầu trong máu từ đó hệ
miễn dich của cá cũng được tăng cường.
3.5.2. Kết quả ảnh hưởng của β-glucan lên tỉ lệ sống của cá bị nhiễm khuẩn
Để khẳng định chế phẩm an toàn cho cá dĩa, những con cá khỏe được chọn để cho ăn thức ăn có trộn chế phẩm, sau khi cho cá ăn ở nồng độ có trộn 1%β-glucan, quan sát
thấy cá vẫn ăn như bình thường. Sau 30 ngày, nồng độ vi khuẩn 105cfu/ml được tim vào
toàn bộ cá ở các nghiệm thức và cá tiếp tục được cho ăn thức ăn có trộn chế phẩm với ba nồng độ khác nhau. Sau khi tiêm khuẩn, cá vẫn ăn nhưng lượng ăn ít hơn trước khi tiêm khuẩn. Sau 10 ngày, ở nghiệm thức 1 cho cá tiếp tục ăn thức ăn có bổ sung β-glucan, cá
chết nhiều với tỉ lệ trên 50% ở nghiệm thức không cho ăn β-glucan (NT đối chứng) và
nghiệm thức trộn β-glucan với nồng độ 0,1%, tương đương với tỉ lệ chết của cá ở nghiệm thức 2 khi khơng cho cá ăn thức ăn có bổ sung β-glucan sau khi tiêm khuẩn vào cá. Ở
nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức bổ sung 0,1% β-glucan, sau khi tiêm khuẩn, 1 số cá có biểu hiện lở lt ở vị trí tiêm và có dấu hiệu xuất huyết ở vùng mang và miệng
Hình 3.88 Cá dĩa bị xuất huyết ở vùng miệng và mang ở NT đối chứng (a) và cá bị lở loét ở vị trí tiêm ở NT bổ sung 0,1% β-glucan (b)
Ở nghiệm thức bổ sung 0,5%, số lượng cá còn sống ở cả 2 nghiệm thức tiếp tục cho ăn và không cho ăn β-glucan khơng có sự thay đổi, tỉ lệ sống đều cao trên 50%, lần lượt là 73,3% và 67,8%. Ở nghiệm thức bổ sung β-glucan cao nhất 1%, tỉ lệ sống của cá đạt khoảng trên 80% và khơng có sự khác biệt giữa việc tiếp tục cho cá ăn β-glucan và khơng cho cá ăn β-glucan.
141
Hình 3.89 Tỉ lệ sống của cá 10 ngày theo dõi sau khi gây nhiễm
Như vậy, β-glucan có ảnh hưởng đến tỉ lệ sống chết của cá dĩa khi cá bị nhiễm
khuẩn. Kết quả có thể do β-glucan làm tăng khả năng miến dịch của cá, giúp cá có khả
năng kháng lại với vi khuẩn gây bệnh Aeromonas hydrophila. Điều này chứng tỏ, β-
glucan có khả năng giúp cá phòng bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila . Liều bổ
sung thích hợp cho cá khi kết hợp với β-glucan là 1%, đồng thời việc tiếp tục bổ sung β- glucan sau khi cá bị nhiễm khuẩn khơng có thay đổi nhiều so với nghiệm thức không bổ sung β-glucan sau khi cá bị nhiễm khuẩn.
Từ kết quả thử nghiệm trên cá xác định được chế phẩm bổ sung cho thức ăn cho cá có thể làm đậm màu của cá và làm tăng hệ miễn dịch cụ thể là tăng tổng số tế bào bạch cầu ở cá là hàm lượng astaxanthin và β-glucan lần lượt là 90mg/kg thức ăn và 10g/kg
thức ăn. Từ đây có thể tạo ra chế phẩm hỗn hợp chứa cả hai chất trong cùng 1 chế phẩm bổ sung cho thức ăn cho cá dĩa có chứa đồng thời astaxanthin và β-glucan như hàm lượng
như trên. Hiện nay trên thị trường là các chế phẩm thô nên sản phẩm rẻ hơn, trong khi
sản phẩm của đề tài là tách chiết so với chất chuẩn cùng đặc tính rẻ hơn rất nhiều. Tuy nhiên sản phẩm đề tài không tan trong nước là đặc tính đúng của astaxanthin, còn thị
142
Chương 4 −KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận
Hoàn thiện quy trình ni cấy chủng nấm men Rhodosporidium sp. theo quy mô pilot bằng hệ thống nuôi cấy dung tích 2 l trên mơi trường rỉ đường đã xử lý.
Đường cong tăng trưởng, thu nhận sinh khối khô và astaxanthin tối ưu khi nuôi
cấy với tỷ lệ giống bổ sung 10% vào thời điểm 74 giờ, cụ thể hàm lượng astaxanthin là 2309,17µg/l và trọng lượng sinh khối khô thu được là 6,1696 g/l hay 374,29 µg/g sinh khối khơ.
Qua các kết quả thu được có thể kết luận mơi trường tăng sinh tốt nhất cho loài H.
pluvialis ở điều kiện phịng thí nghiệm đã thực hiện là BG11 ở điều kiện sục khí với cường độ ánh sáng 2Klux, thời gian chiếu 12 giờ ở 25oC trong thời gian 14 ngày.
Trong giai đoạn tạo astaxanthin:
- Đối với môi trường BG11 ni tĩnh thì từ 18 ngày trở đi mới có sự tích lũy astaxanthin. Khi tăng nhiệt độ lên 37oC thì thời gian bắt đầu tích lũy là ngày thứ
10 và đạt 2,68% ở ngày thứ 22.
- Đối với môi trường RM khơng có nitơ và phospho với thời gian chiếu sáng 24
giờ/ngày hàm lượng astaxanthin tích lũy chiếm tới 2,67% trọng lượng tế bào chỉ sau 10 ngày gây stress.
Chúng tôi đã xác định được quy trình tách chiết astaxanthin từ Rhodosporidium
sp.:
· Tế bào nấm men sau khi rửa sạch trong đệm PBS
· Ly tâm, thu sinh khối, xử lý sinh khối với HCl trong 45 phút · Bổ sung dung môi ethylete tách chiết
· Lắc hỗn hợp chiết liên tục ở tốc độ 200 vòng/phút trong 1 giờ, ở 30oC · Ly tâm thu dịch nổi có chứa astaxanthin
· Đuổi dung mơi, sấy khơ chân không và thu nhận chế phẩm astaxanthin
Chúng tôi cũng đã xác định được quy trình tách chiết astaxanthin từ tảo
Haematococcus pluvialis với hàm lượng astaxanthin thu được trong mẫu chiết với