Mẫu
β-glucan (% w/w)
POLY1 64,8704 ± 2,5523 POLY2 18,1757 ± 0,3221
Hiệu suất của cả quy trình thí nghiệm hàm lượng β-glucan tính trên khối lượng sinh khối khô nấm men mẫu POLY1 là 9,31 % (g/g)
Hiệu suất của cả quy trình thí nghiệm hàm lượng β-glucan tính trên khối lượng sinh khối khô nấm men mẫu POLY2 là 0,69 %(g/g)
Từ kết quả định lượng β-glucan mẫu POLY1, chúng tôi nhận thấy độ tinh sạch của mẫu cao 64,52 % phù hợp với hiệu suất tách chiết β-glucan bằng cách tách chiết theo
phương pháp hóa học bằng kiềm là khoảng 50 – 80 % [18]
Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H NMR
Hình 3.57 là kết quả phổ đã được chạy phổ 1H NMR của mẫu POLY1 (mã hóa: β-glu1), dung mơi D2O.
Hình 3.58 là giãn phổ của hình 3.57 phổ 1H NMR của mẫu POLY1 (mã hóa: β-
103
Hình 3.57: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân1
H NMR 500-MHz POLY1 (10mg/ml, dung mơi D2O)
104
Hình 3.58: Giãn phổ cộng hưởng từ hạt nhân1H NMR 500-MHz POLY1(10mg/ml, dung môi D2O)
Dựa vào hình 3.5, chúng tơi thấy khi chạy phổ cộng hưởng từ hạt nhân1H NMR β-
glucan tách chiết đã biểu hiện một dãy các peak chuẩn tại 5.3 (1H), 4.9 (dung mơi D2O hịa tan cịn sót lại trong mẫu), 4.5 (1H), 3.7 (1H) ppm.Các tín hiệu mà xuất hiện một đơi proton tại 3,60 ppm.Các tín hiệu hydroxyl ở 4.23 ppm có thể được chỉ định như HO-6 kể từ khi nó xuất hiện và được nối với proton C-6. Một trong những proton C6 xuất hiện
như một đôi proton (Ji 6, J2 11 Hz) tại 3,7 ppm. Các cịn lại tín hiệu hydroxyl ở gần 4,5 ppm có thể được chỉ định như HO-4 và được nối với H-4. Khi so sánh với phổ cộng hưởng từ hạt nhân, có thể thấy sự tương đồng về các peak β-glucan [23]
Hình 3.59 là kết quả phổ đã được chạy phổ 1H NMR của mẫu POLY2 (mã hóa β-
105
Hình 3.59: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân1
H NMR 500-MHz POLY2(10mg/ml, dung mơi D2O)
Trong hình 3.59, chúng tơi có thể thấy mẫu POLY2 tách chiết có quá nhiều tạp
chất và không tan tốt trong dung mơi nên tạp chất cịn ở chất nền khơng biểu hiện rõ ràng lên các peak nên khơng có mẫu giãn phổ. Dẫn đến, khó có thể xác định được cấu trúc tương đồng β-glucan chuẩn.
3.3.2 Điều kiện thích hợp cho ly trích polysaccharide giàu β-glucan từ tế bào
106
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ quy trình thí nghiệm
Chú thich:
PL 1: polysaccharide sau khi ly trich tử vách tế bào men bia PL 2: polysaccharide của dịch sau khi li giải tế bào nấm men bia PL 3: Polysaccharide sau khi ly trích từ vách tế bào men bánh mì PL 4: Polysaccharide của dịch sau khi li giải tế bào men bánh mì
3.3.2.1 Đánh giá nguồn nguyên liệu đầu vào
Đánh giá bã men bia
Số tế bào nấm men có trong 1 ml dịch 2% là 78,72 ± 1,01 x 106 (tế bào)
Hàm lượng đường ngoại bào là 3,73 ± 0,00 (mg/g) tế bào nấm men Hàm lượng protein ngoại bào là 112,7± 0,00 (mg/g) tế bào nấm men
107
Số tế bào nấm men có trong 1 ml dịch 2% là 472 ± 36,77 x 106 (tế bào)
Hàm lượng đường ngoại bào là 0,82 ± 0,00 (mg/g)tế bào nấm men Hàm lượng protein ngoại bào là 13,55± 0,00 (mg/g) tế bào nấm men
Vì hàm lượng đường và protein ngoại bào ở cả 2 nguồn nguyên liệu còn khá lớn nên chúng tôi quyết định khảo sát số lần rửa tế bào ở cả 2 nguồn nguyên liệu trên để thu
được chất lượng nấm men sạch hơn.
Khảo sát số lần rửa tế bào nấm men
Chúng tôi quyết định chọn dung dịch NaCl 5 % để rửa tế bào nấm men sẽ rửa được nhiều đường và protein ngoại bào hơn.
Khảo sát số lần rửa tế bào nấm men từ bã men bia
Nấm men bia sau khi được thu về từ cơng ty bia sài gịn cịn tồn tại lượng đáng kể
đường (3,73 mg/g tế bào nấm men) và protein (112,7 g/mg tế bào nấm men) cho nên ta
tiến hành khảo sát số lần rửa tế bào nấm men bia để nhằm loại bỏ phần lớn những chất
trên đồng thời trong quá trình rửa như vậy cũng loại bỏ đi phần lớn những tạp chất cặn bả
trong quá trình lên men bia như chất đắng. Biểu đồ hình 3.60 và hình 3.61 sẽ cho ta thấy rõ hơn hàm lượng đường và protein giảm qua các lần rửa.
Dựa trên bảng và biểu đồ hình 3.60 ta thấy lượng đường trong dịch rửa giảm sau mỗi lần rửa, cụ thể 1,81mg/g ở lần rửa 1 và 0,01mg/glần rửa thứ 5.Lần rửa thứ 1 thì lượng đường giảm 48,5 %, lần thứ 2 lượng đường giảm 33,24%, lần thứ 3 giảm 8,9%, lần
thứ 4 giảm 3,74% , lần thứ 5 giảm 0.26%. Như vậy hàm lượng đượng sau 3 lần rửa đầu giảm khá nhiều nhưng bắt đầu từ lần 4 thì hàm lượng đường giảm khá ít.
108
Dựa trên bảng và biểu đồ hình 3.60 ta thấy lượng đường trong dịch rửa giảm sau mỗi lần rửa, cụ thể 1,81mg/g ở lần rửa 1 và 0,01mg/glần rửa thứ 5.Lần rửa thứ 1 thì lượng đường giảm 48,5 %, lần thứ 2 lượng đường giảm 33,24%, lần thứ 3 giảm 8,9%, lần
thứ 4 giảm 3,74% , lần thứ 5 giảm 0.26%. Như vậy hàm lượng đượng sau 3 lần rửa đầu giảm khá nhiều nhưng bắt đầu từ lần 4 thì hàm lượng đường giảm khá ít.
Hình 3.60: Hàm lượng đường trong dịch rửa qua các lần rửa tế bào nấm men bia
109
Dựa trên bảng và biểu đồ 3.61 ta thấy lượng protein giảm sau mỗi lần rửa, cụ thể 54,31mg/g ở lần rửa 1 và 3,04 mg/glần rửa thứ 5. Lần rửa thứ 1 thì lượng protein giảm 48,2 %, lần thứ 2 lượng protein giảm 26,1 %, lần thứ 3 giảm 12,1 %, lần thứ 4 giảm 3,9 % , lần thứ 5 giảm 2,7 %, qua kết quả này ta thấy lượng protein ở lần 4, 5 không giảm
nhiều so với lần 1, 2, 3.
Kết hợp kết quả hàm lượng đường và protein qua các lần rửa trên chúng tôi quyết
định chọn số lần rửa là 3 lần để rửa tế bào nấm men bia
Khảo sát số lần rửa tế bào nấm men bánh mì
Cũng giống như nấm men bia nấm men bánh mì được mua về cũng chứa một hàm
lường đường và protein đáng kể vì vậy ta cần phải rửa tế bào nấm men nhằm thu được tế
bào nấm men sạch. Biểu đồ 3.62 và 3.63 sẽ cho ta thấy rõ hơn.
Qua biểu đồ hình 3.62 ta thấy lượng đường giảm sau mỗi lần rửa, cụ thể 0,38mg/g
ở lần rửa 1 và 0.1mg/g lần rửa thứ 5. Lần rửa thứ 1 thì lượng đường giảm 46,3 %, lần thứ 2 lượng đường giảm 25,6 %, lần thứ 3 giảm 15,9 %, lần thứ 4 giảm 13,4% , lần thứ 5
giảm 12,2 %. Như vậy hàm lượng đượng sau 3 lần rửa đầu giảm khá nhiều nhưng bắt đầu từ lần 4 thì hàm lượng đường giảm khá ít.
110
Qua biểu đồ 3.63 ta thấy lượng protein giảm sau mỗi lần rửa, cụ thể 6,48mg/g ở
lần rửa 1 và 0,72 mg/g lần rửa thứ 5. Lần rửa thứ 1 thì lượng protein giảm 47,8 %, lần thứ
2 lượng protein giảm 21,25 %, lần thứ 3 giảm 8,2 %, lần thứ 4 giảm 6,05 % , lần thứ 5
giảm 5,3 %, qua kết quả này ta thấy lượng protein ở lần 4, 5 không giảm nhiều so với lần 1, 2, 3.
Kết hợp kết quả hàm lượng đường và protein qua các lần rửa trên chúng tôi quyết
định chọn số lần rửa là 3 lần để rửa tế bào nấm men bánh mì
Sau khi tiến hành rửa tế bào nấm men ta tiếp túc tiến hành li giải nấm men để thu
được vách tế bào
3.3.2.2 Khảo sát thời gian li giải tế bào nấm men
ü Khảo sát thời gian li giải tế bào nấm men bia
Nhằm đảm bảo tế bào nấm men bia li giải hoàn toàn cho nên ta tiến hành khảo sát thời gian li giải để biết được tổng thời gian li giải của tế bào nấm men là bao nhiêu. Biểu
đồ 3.64 sẽ cho ta thấy điều đó.
111
Dựa vào bảng và biểu đồ 3.64 ta thấy được có sự thay đổi hàm lượng protein qua thời gian từ 0 giờ đến 27 giờ, hàm lượng protein tăng từ 139,17 mg/g mốc (0 giờ) đến 163,33 mg/g mốc (22 giờ) điều này có thể chứng minh rằng tế bào nấm men bị li giải trong khoảng từ 0 – 22 giờ, và ở mốc 23, 24, 25, 26, 27 giờ hàm lượng protein giảm từ
163,33 mg/g (mốc 22 giờ) đến 161.67 mg/g (mốc 23 giờ) cho ta thấy tế bào nấm men đã ngừng li giải chứng minh rằng tế bào nấm men đã li giải hồn tồn ở mốc 22 giờ. Điều này có thể giải thích là dung dịch NaOH có thể hịa tan được protein, mannan, chitin của vách tế bào nấm men từ đó phá vỡ cấu trúc vách làm cho nội dung bên trong tế bào chủ yếu là protein giải phóng ra mơi trường ngồi, tuy nhiên vì tế bào nấm men chỉ có 1
lượng protein nhất định nên khi nấm men bị li giải hồn tồn thì lúc này hàm lượng
protein cũng đạt giá trị cao nhất. Từ kết quả trên chúng tôi quyết định chọn thời gian li giải tế bào nấm men là 22 giờ.
ü Khảo sát thời gian li giải tế bào nấm men bánh mì
Nhằm đảm bảo tế bào nấm men bánh mì li giải hoàn toàn cho nên ta tiến hành khảo sát thời gian li giải để biết được tổng thời gian li giải của tế bào nấm men là bao
nhiêu. Biểu đồ 3.65 sẽ cho ta thấy điều đó.
112
Dựa vào bảng và biểu đồ 3.65 ta thấy được có sự thay đổi hàm lượng protein ở các mốc thời gian từ 0, 5, 6, 16 giờ hàm lượng protein tăng từ 443,33mg/g (mốc 0 giờ) lên 475,83 mg/g (mốc 16 giờ) chứng minh rằng tế bào nấm men bị li giải trong khoảng từ 0 giờ – 16 giờ, và ở mốc 21 giờ, 22 giờ, 23 giờ hàm lượng protein giảm từ 475 mg/g (mốc 21 giờ) đến 463,33 mg/g (mốc 23 giờ) cho ta thấy tế bào nấm men đã ngừng li giải chứng minh rằng tế bào nấm men đã li giải hồn tồn ở mốc 21 giờ. Điều này có thể giải thích là dung dịch NaOH có thể hịa tan được protein, mannan, chitin của vách tế bào nấm men từ
đó phá vỡ cấu trúc vách làm cho nội dung bên trong tế bào chủ yếu là protein giải phóng ra mơi trường ngồi, tuy nhiên vì tế bào nấm men chỉ có 1 lượng protein nhất định nên
khi nấm men bị li giải hồn tồn thì lúc này hàm lượng protein cũng đạt giá trị cao nhất. Từ kết quả trên chúng tôi quyết định chọn mốc thời gian 21 giờ là thời gian li giải tế bào nấm men bánh mì
Như vậy thời gian li giải của tế bào nấm men bia và nấm men bánh mì có sự chênh
lệch, cụ thể là thời gian li giải của tế bào nấm men bia là 22 giờ và ở nấm men bánh mì là 21 giờ, chênh lệch khoảng 1 giờ là không đáng kể.
113
Sau khi li giải hoàn toàn tế bào nấm men ta thu được vách tế bào nấm men, tiếp tục tiến hành khảo sát các điều kiện tối ưu nhằm thu được hiệu suất tách chiết β-glucan tối ưu.
3.3.2.3 Hiệu suất thu vách tế bào sau li giải
Hiệu suất thu vách tế bào sau khi li giải được trình bày ở bảng sau: