CHƯƠNG II : NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.3 Nội dung 3 Nghiên cứu quy trình tách chiết astaxanthin từ Rhodosporidium sp và
và vi tảo Haematococcus pluvialis
2.3.1 Quy trình tách chiết astaxanthin từ nấm men sử dụng dung môi hữu cơ
Rửa sạch tế bào nấm men trong đệm PBS Ly tâm, thu sinh khối sạch
Xử lý sinh khối với HCl ở nồng độ thích hợp trong 45 phút Bổ sung dung môi tách chiết
Lắc hỗn hợp chiết liên tục ở tốc độ 200 vòng/phút trong 1 giờ, ở 30oC Ly tâm thu dịch nổi có chứa astaxanthin
Đuổi dung môi, sấy khô chân không và thu nhận chế phẩm astaxanthin
2.3.2 Phương pháp tách chiết astaxanthin từ Haematococcus pluvialis
Nguyên tắc
Thành tế bào H. pluvialis khá vững chắc với 70 % là carbohydrate, 3%
cellulose mà astaxanthin được tích lũy bên trong tế bào. Mà DMSO là dung mơi có khả năng phá thành tế bào nên sẽ giúp q trình chiết có hiệu quả tốt hơn.
Cách tiến hành
- Loại bỏ chlorophyll
Các tế bào nang H.pluvialisđược xử lí với 5%KOH trong 30% methanol
27
°C, phần tủa được rửa sạchvới 2 ml nước cất và bổ sung vài giọt acid acetic để đưa pH về trung tính [45].
- Tách chiết astxanthin bằng DMSO và acetone
Phần sinh khối khôsau khi loại chlorophyll sẽ ủ trong 10ml DMSO ở 55oC. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi chứa DMSO. Thực hiện phá thành tế bào 2 lần với DMSO.
Thêm vào phần tủa 5ml acetone, vortex kĩ sau đó ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi (chiết 2-3 lần đến khi phần cặn hết sắc tố).
Gom chung tất cả dịch chiết DMSO và acetone vào bình lắng. Thêm petrolium ether (tỉ lệ petrolium ether:dịch chiết là 1:2) và 10ml nước cất, thêm 5ml NaCl bão hòa nếu sắc tố khơng tách pha. Thu pha petrolium ether có chứa sắc tố ở phía trên.
Thêm nước vào dịch chiết sắc tố (tỉ lệ 1:1) bỏ pha nước (chứa acetone,
DMSO), thu dịch chiết sắc tố trong pha petrolium ether phía trên. Lặp lại bước này 3-5 lần để loại hoàn toàn DMSO và acetone.
Thêm Na2SO4 khan để loại nước, thu dịch nổi sắc tố trong pha petrolium ether. Thêm petrolium ether để tất cả đạt một thể tích nhất định.
Đo độ hấp thu của dịch chiết ở bước sóng 468nm [8].
2.3.3 So sánh phương pháp tách chiết bằng bột thủy tinh và DMSO
- Tách chiết bằng bột thủy tinh
Nghiền 0,005g sinh khối tảo khô đã được loại chlorophyll trong 0,01g bột thủy tinh, sau đó chiết 2 lần với acetone, ly tâm thu dịch ở 5000 vòng/phút trong 10 phút [70].
Gom chung tất cả dịch chiết acetone vào bình lóng. Thêm petrolium ether (tỉ lệ petrolium ether:dịch chiết là 1:2) và 10ml nước cất, thêm 5ml NaCl bão hịa nếu sắc tố khơng tách pha. Thu pha petrolium ether có chứa sắc tố ở phía trên.
Thêm nước vào dịch chiết sắc tố (tỉ lệ 1:1) bỏ pha nước (chứa acetone, DMSO),
thu dịch chiết sắc tố trong pha petrolium ether phía trên. Lặp lại bước này 3-5 lần để loại hoàn toàn acetone.
28
Thêm Na2SO4 khan để loại nước, thu dịch nổi sắc tố trong pha petrolium ether.
Thêm petrolium ether để tất cả đạt một thể tích nhất định. - Tách chiết bằng DMSO
0,005 g sinh khối khô sau khi được loại cholorophyll sẽ được tách chiết theo quy trình như đã trình bày ở mục trên.
Đo độ hấp thu của các dịch chiết ở bước sóng 468 nm [8].
2.3.4 Phương pháp đánh giá hàm lượng astaxanthin của Rhodosporidium sp và vi
tảo Haematococcus pluvialis
2.3.4.1 Định tính astaxanthin bằng phương pháp sắc kí bản mỏng (TLC)
Sắc tố sau khi được tách chiết thì tiến hành chạy sắc kí lớp mỏng để xác định sự có mặt của astaxanthin trong dịch chiết, cách tiến hành như sau:
- Bản sắc kí sau khi được kẻ 2 đường viết chì cách đáy và đỉnh 1cm thì chấm sắc tố lên 1 đường kẻ, điểm chấm phải đậm, để khô tự nhiên, yêu cầu chiều dài bản sắc kí là 10cm.
- Cho hệ dung mơi acetone:hexan tỉ lệ 1:4 vào bồn sắc kí, cho bản sắc kí vào khi hệ dung mơi đã bão hòa.
- Lấy giấy sắc kí ra khỏi bồn khi dung môi chạy tới điểm cách đỉnh 1cm,
đánh dấu mực dung môi.
- Sau khi giấy khơ hồn tồn, đo khoảng cách di chuyển của số tố, tính Rf của sắc tố.
Rf = (CT 2.1)
Kết quả chạy sắc kí của mẫu sắc tố tách chiết được so sánh với mẫu astaxanthin
thương mại được sản xuất bởi công ty DSM Nutritional Products Vietnam Ltd. [6]
2.3.4.2 Định tính astaxanthin bằng phương pháp qt bước sóng
Sắc tố sau khi được tách chiết thì tiến hành quét bước sóng từ 300 nm – 600 nm để
xác định sự có mặt của astaxanthin trong dịch chiết. Sau đó so sánh với bước sóng hấp
29
2.3.4.3 Định lượng astaxanthin theo công thức Kelly-Harmon (1972)
Dựa vào độ hấp thụ ở bước sóng 468 nm của dịch chiết thu được có thể tính được
hàm lượng astaxanthin theo công thức sau:
X = (CT 2.2) [8,27]
trong đó; X: hàm lượng astaxanthin (µg/g).
A468: Độ hấp thu của dịch chiết sắc tố trong dung môi ether dầu hỏa ở 468 nm.
V: thể tích dịch chiết sắc tố (ml)
E 1cm: độ hấp thu dung dịch astaxanthin 1% trong dung môi PE (với
cuvette 1cm).
G: trọng lượng sinh khối nấm men/tảo (g).
- Hàm lượng Astaxanthin được xác định bằng phương pháp của Kelly-Harmon (1972) hoặc phương pháp HPLC.