CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Khảo sát điều kiện nuôi cấy chủng nấm men Rhodosporidium sp
3.1.1 Khảo sát môi trường phù hợp cho sự sinh trưởng tạo sắc tố của Rhodosporidium sp.
3.1.1 Khảo sát môi trường phù hợp cho sự sinh trưởng tạo sắc tố của Rhodosporidium sp. sp.
Vì mục tiêu ban đầu của nhóm là phân lập nhóm vi sinh vật đơn bào, kể cả nấm men và vi khuẩn, có màu sắc tố từ vàng đến đỏ có tiềm năng trong việc sinh tổng hợp
carotenoid mà đặc biệt là astaxanthin nên môi trường phân lập được sử dụng là YM. Tuy nhiên, sau khi định danh chủng VS01 có khả năng sinh tổng hợp astaxanthin
thuộc nhóm nấm men hồng có tên khoa học là Rhodosporidium sp., cần phải xác định
mơi trường thích hợp để nuôi cấy và bảo quản chủng nấm men này trong phịng thí
nghiệm. Mơi trường được đưa ra để đánh giá là môi trường Hansen, môi trường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy nấm men.
3.1.1.1 Đường cong tăng trưởng của Rhodosporidium sp. trên môi trường YM và Hansen
Rhodosporidium sp. được nuôi cấy trong môi trường lỏng và lắc tròn 200 vòng/phút. Đường cong tăng trưởng của Rhodosporidium sp. khi nuôi cấy trên mơi
35
Hình 3.1: Đồ thị đường cong tăng trưởng của Rhodosporidium sp. trên môi trường YM và Hansen. Sự khác nhau giữa các giá trị trung bình là có ý nghĩa thống kê (n=3, p <
0,05)
Kết quả cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về sự tăng trưởng của
Rhodosporidium sp. trên môi trường YM và Hansen. Cụ thể, pha tiềm tàn nằm trong
khoảng 6 giờ đầu tiên, pha log nằm trong khoảng từ giờ thứ 7 đến giờ thứ 42, pha ổn định nằm trong khoảng từ giờ thứ 43 đến giờ thứ 58, pha suy tàn là từ giờ 59 trở đi.
Khi so sánh tế bào và khuẩn lạc Rhodosporidium sp. khi tăng trưởng trên môi trường YM và Hansen cũng cho thấy khơng có sự khác biệt đáng kể về mặt hình thái tế
36
Hình 3.2: Hình thái tế bào (1) và khuẩn lạc (2) của Rhodosporidium sp. trên môi trường
YM (A) và môi trường Hansen (B). Tế bào được quan sát với độ phóng đại x400.
3.1.1.2 Hàm lượng astaxanthin được tích lũy/sinh tổng hợp trong tế bào
Rhodosporidium sp. ở môi trường YM và Hansen
Tiếp theo, hàm lượng astaxanthin được tích lũy hoặc sinh tổng hợp trong tế bào
Rhodosporidium sp. được đánh giá thông qua các phương pháp định tính (wavescan, sắc
ký bản mỏng – TLC) và định lượng.
Độ hấp thu của dịch chiết sắc tố trong dung môi acetons: trong cả hai môi trường
khảo sát thì chủng nấm men Rhodosporidium toruloides đều có đỉnh hấp thu cực đại
trong dung môi acetone ở bước sóng 477 nm so với đỉnh hấp thu cực đại của chất chuẩn astaxanthin cũng ở 477 nm do đó có thể xác định sơ bộ là chủng nấm men
Rhodosporidium toruloides có khả năng sinh astaxanthin ở cả môi trường Hansen và Yeast Malt Broth (YM).
Thêm vào đó, kết quả sắc ký lớp mỏng ở hình 3.3 cho thấy chủng Rhodosporidium sp. nuôi trong môi trường Hansen và YM đều có vạch sắc tố ngang với chất chuẩn
(Rf = 0,22), dịch sắc tố của hai mơi trường đều có các vạch màu tương đồng nhau nhưng trong cùng một thể tích mẫu chấm sắc ký lại có độ đậm nhạt khác nhau chứng tỏ có sự khác nhau về hàm lượng astaxanthin tạo ra trong hai mơi trường.
37
Hình 3.3: Sắc ký đồ của dịch chiết sắc tố Rhodosporidium sp. trên hai môi trường khác
nhau. Thu dịch chiết sắc tố từ hai môi trường Yeast Malt Broth (YM) và Hansen lấy 0,5 ml mỗi mơi trường đi chấm sắc kí lớp mỏng với astaxanthin chuẩn trong hệ dung môi n-
Hexan:acetone (4:1). YM: Môi trường Yeast Malt Broth; Ast: Astaxanthin chuẩn; Hansen: Môi trường Hansen
Kết quả định lượng astaxanthin ly trích từ tế bào Rhodosporidium sp., sau khoảng 72 giờ ni cấy, theo cơng thức của Kelly-Harmon (1972), được trình bày theo biểu đồ hình 3.4, cho thấy có sự khác biệt về hàm lượng astaxanthin được sinh tổng hợp/tích lũy trong Rhodosporidium sp. và hàm lượng astaxanthin ở môi trường Hansen cao hơn gần 3 lần so với môi trường Yeast Malt Broth (YM) có thể giải thích là do thành phần mơi
trường Hansen hai yếu tố khống là MgSO4 3 (g/l), KH2PO4 3 (g/l) trong khi thành phần
mơi trường YM thì khơng có khống. Vậy nên, trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi quyết định khảo sát các đặc điểm hình thái và tối ưu hố các yếu tố ảnh hưởng trên mơi
38
Hình 3.4: Biểu đồ đánh giá hàm lượng astaxanthin thu được khi nuôi cấy nấm men trên
môi trường YM và Hansen. Hàm lượng astaxanthin thu được từ hai mơi trường có khác
biệt với n = 3, p < 0,0001
3.1.2 Khảo sát điều kiện thích hợp cho ni cấy Rhodosporidium sp. trên mơi trường Hansen
Từ các khảo sát trên đây, môi trường Hansen là mơi trường thích hợp cho quá trình ni cấy Rhodosporidium sp. sinh tổng hợp/tích lũy astaxanthin in vitro. Tuy nhiên, cơng thức của môi trường Hansen: glucose (50 g/l), peptone (10 g/l), KH2PO4 (3 g/l), MgSO4.7H2O (2 – 5 g/l) và pH 6 được xác định là tích hợp cho ni cấy Saccharomyces
cerevisae. Do đó, cần xác định lại thành phần môi trường Hansen phù hợp cho nuôi cấy Rhodosporidium sp. sao cho sinh tổng hợp/tích lũy nhiều astaxanthin nhất.
3.1.2.1 Khảo sát sự thay đổi của hàm lượng astaxanthin được sinh tổng hợp/ tích trữ trong tế bào Rhodosporidium sp.
Dựa vào đường cong sinh trưởng của Rhodosporidium sp. trên môi trường Hansen (Hình 3.1), chúng tơi tiến hành nuôi cấy và thu sich khối Rhodosporidium sp. ở những
khoảng thời gian khác nhau tính từ lúc dịch ni cấy bắt đầu có màu đậm: 32 giờ và 38 giờ (pha tăng trưởng), 62 giờ (cuối pha ổn định), 72 giờ và 96 giờ (pha suy tàn). Kết quả
39
Bảng 3.1: Lượng sinh khối khơ thu được (g), hàm lượng astaxanthin tính trên sinh khối khơ (mg/g) và thể tích canh trường nuôi cấy (mg/l) ở những thời điểm nuôi cấy
khác nhau
Thời gian
Lượng sinh khối khơ
(g/ lít) Hàm lượng astaxanthin (mg/g) Hàm lượng astaxanthin (mg/l) 32 4.2770 ± 0.1553 108.87 ± 4.399 464.29 ± 3.464 38 4.4051 ± 0.0969 194.80 ± 5.083 857.14 ± 3.464 62 4.3336 ± 0.1822 311.02 ± 13.746 1342.85 ± 4.041 72 4.6892 ± 0.1273 301.96 ± 6.545 1414.29 ± 8.083 96 4.5520 ± 0.1271 299.69 ± 7.670 1362.27 ± 3.421
Hình 3.5: Biểu đồ đánh giá hàm lượng astaxanthin thu được khi nuôi cấy nấm men trên
môi trường Hansen ở những khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau. Các chữ cái ở đỉnh
cột biểu đồ biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với n = 3, p < 0,0001
Kết quả cho thấy khơng có sự thay đổi nhiều về hàm lượng astaxanthin được tích lũy trong tế bào nấm men kể từ 62 giờ. Do đó, thời điểm thích hợp để thu sinh khối nấm
40
men phục vụ cho quá trình ly trích astaxanthin nằm ở cuối pha ổn định và pha suy tàn. Để
đảm bảo cho sự tích lũy astaxanthin khơng bị thay đổi nhiều khi đánh giá ở những thí
nghiệm sau, chúng tôi chọn 72 giờ là thời điểm thu sinh khối nấm men để ly trích astaxanthin cho những thí nghiệm sau.
3.1.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH
Giá trị pH của môi trường Hansen được thay đổi từ 3,0 đến 8,0. Kết quả đánh giá
hàm lượng astaxanthin được sinh tổng hợp/tích lũy ở những pH khác nhau được trình bày
theo bảng 3.2 và biểu đồ hình 3.6.
Bảng 3.2: Lượng sinh khối khơ thu được (g), hàm lượng astaxanthin tính trên sinh khối khơ (mg/g) và thể tích canh trường ni cấy (mg/l) ở những pH môi trường khác
nhau
pH
Lượng sinh khối khơ
(g/ lít) Hàm lượng astaxanthin (mg/g) Hàm lượng astaxanthin (mg/l) 3.0 1.5454 ± 0.0169 122.48 ± 3.878 189.14 ± 4.041 3.5 1.5204 ± 0.0098 121.37 ± 2.297 184.57 ± 4.619 4.0 1.6433 ± 0.0163 218.72 ± 0.624 359.43 ± 3.464 4.5 2.4327 ± 0.0058 224.57 ± 5.289 546.29 ± 12.122 5.0 2.3531 ± 0.0034 225.11 ± 1.954 529.71 ± 5.199 5.5 2.4993 ± 0.0338 282.27 ± 5.201 705.14 ± 4.041 6.0 3.7235 ± 0.0053 291.28 ± 1.178 1084.57 ± 3.464 6.5 3.6818 ± 0.0038 278.28 ± 1.063 1024.57 ± 4.623 7.0 2.4311 ± 0.0209 125.99 ± 0.693 306.29 ± 3.464 7.5 2.1160 ± 0.0061 47.00 ± 3.099 99.429 ± 6.351 8.0 1.0266 ± 0.0157 34.36 ± 5.102 35.43 ± 5.774
41
Hình 3.6: Biểu đồ đánh giá hàm lượng astaxanthin thu được khi nuôi cấy nấm men trên
môi trường Hansen ở những pH nuôi cấy khác nhau. Các chữ cái ở đỉnh cột biểu đồ biểu
thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với n = 3, p < 0,0001
Kết quả cho thấy, Rhodosporidium sp. có thể sinh trưởng trong khoảng pH rộng từ
3 đến 8. Tuy nhiên, pH 6 là pH phù hợp cho việc nuôi cấy Rhodosporidium sp. sinh tổng
hợp/tích lũy astaxanthin.
3.1.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của glucose
Sử dụng pH 6 thích hợp đã xác định ở thí nghiệm trên, yếu tố tiếp theo được thay
42
của môi trường Hansen được giữ nguyên như công thức của môi trường Hansen ban đầu. Kết quả đánh giá hàm lượng astaxanthin được sinh tổng hợp/tích lũy ở những nồng độ D-
glucose khác nhau được trình bày theo bảng 3.3 và biểu đồ hình 3.7.
Bảng 3.3: Lượng sinh khối khô thu được (g), hàm lượng astaxanthin tính trên sinh khối khơ (mg/g) và thể tích canh trường ni cấy (mg/l) ở những nồng độ D-glucose
khác nhau
Nồng độ D- glucose (g/l)
Lượng sinh khối
khơ (g/ lít) Hàm lượng astaxanthin (mg/g) Hàm lượng astaxanthin (mg/l) 30 2.1310 ± 0.0082 459.29 ± 3.464 215.52 ± 0.796 35 2.1450 ± 0.0115 524.29 ± 2.887 244.45 ± 2.655 40 2.6510 ± 0.0346 704.29 ± 5.773 265.70 ± 1.294 45 3.2750 ± 0.0231 1115.71 ± 5.773 340.74 ± 4.166 50 3.2640 ± 0.0046 1072.86 ± 9.815 328.69 ± 2.542 55 3.4630 ± 0.0058 773.57 ± 3.467 223.38 ± 0.629 60 3.5460 ± 0.0156 706.43 ± 3.464 199.22 ± 0.101 65 3.8570 ± 0.0232 627.86 ± 4.619 162.78 ± 0.218 70 4.0420 ± 0.0359 645.00 ± 5.637 159.58 ± 0.023
43
Hình 3.7.1: Biểu đồ đánh giá hàm lượng astaxanthin thu được khi nuôi cấy nấm men trên
môi trường Hansen ở những nồng độ glucose nuôi cấy khác nhau. Các chữ cái ở đỉnh cột
biểu đồ biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với n = 3, p < 0,05
Kết quả cho thấy nồng độ D-glucose 45 g/l là thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp/tích lũy astaxanthin ở nấm men Rhodosporidium sp. khi mà hàm lượng
astaxanthin cũng như sinh khối thu được đạt giá trị cao nhất ở nồng độ D-glucose này.
3.1.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của pepton
Giữ nguyên giá trị pH 6 và nồng độ D-glucose 45 g/l thích hợp đã xác định, thành phần tiếp theo được thay đổi nồng độ để khảo sát là pepton. Hàm lượng của các thành phần còn lại của môi trường Hansen được giữ nguyên như công thức của môi trường Hansen ban đầu. Kết quả đánh giá hàm lượng astaxanthin được sinh tổng hợp/tích lũy ở những nồng độ pepton khác nhau được trình bày theo bảng 3.4 và biểu đồ hình 3.8.
44
Bảng 3.4: Lượng sinh khối khô thu được (g), hàm lượng astaxanthin tính trên sinh khối khơ (mg/g) và thể tích canh trường ni cấy (mg/l) ở những nồng độ pepton
khác nhau
Nồng độ pepton (g/l)
Lượng sinh khối khơ
(g/ lít) Hàm lượng astaxanthin (mg/g) Hàm lượng astaxanthin (mg/l) 2 1.2340 ± 0.0001 198.54 ± 9.031 245.00 ± 11.167 4 1.5450 ± 0.0074 219.63 ± 3.301 339.29 ± 3.464 6 1.8500 ± 0.0677 265.80 ± 7.553 490.71 ± 4.041 8 2.6750 ± 0.0053 310.54 ± 2.843 830.71 ± 9.238 10 3.2647 ± 0.0015 331.90 ± 1.613 1083.57 ± 5.765 12 3.4630 ± 0.0221 295.61 ± 3.047 1023.58 ± 4.032 14 3.4460 ± 0.0075 308.65 ± 2.180 1063.57 ± 5.196 16 3.5520 ± 0.0065 307.48 ± 1.047 1092.14 ± 1.731 18 4.1450 ± 0.0075 258.84± 1.862 1072.86 ± 5.774
45
Hình 3.7.2: Biểu đồ đánh giá hàm lượng astaxanthin thu được khi nuôi cấy nấm men trên
môi trường Hansen ở những nồng độ pepton nuôi cấy khác nhau. Các chữ cái ở đỉnh cột
biểu đồ biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với n = 3, p < 0,05
Kết quả cho thấy mặc dù từ nồng độ pepton 8 g/l tăng dần khơng có sự thay đổi
hàm lượng astaxanthin một cách đáng kể trong tế bào nấm men. Tuy nhiên, do sinh khối
46
trên thể tích ni cấy là cao nhất ở nồng độ pepton 10 g/l. Do đó, 10 g/l là nồng độ pepton thích hợp cho ni cây Rhodosporidium sp. sinh astaxanthin.
3.1.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của MgSO4 và KH2PO4
Giữ nguyên giá trị pH 6, nồng độ D-glucose 45 g/l, nồng độ pepton 10 g/l thích hợp. Chúng tơi tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thành phần khoáng đến sự sinh tổng hợp/tích lũy astaxanthin.
Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của khoáng đến sự sinh tổng hợp/tích lũy
astaxanthin được thực hiện trên 4 nghiệm thức ứng với 4 môi trường khác nhau:
- Môi trường 4 (MT4) gồm glucose 45 (g/l), pepton 10 (g/l), MgSO4 3.0 (g/l), KH2PO4 3.0 (g/l), pH 6.0 ở điều kiện nhiệt độ phòng (280C ± 20C) và ánh sáng tự nhiên.
- Môi trường 2 (MT2) tương tự môi trường 4 nhưng thiếu thành phần MgSO4. - Môi trường 3 (MT3) tương tự môi trường 4 nhưng thiếu thành phần KH2PO4. - Môi trường 1 (MT1) tương tự môi trường 4 nhưng thiếu thành phần KHPO4 và
MgSO4.
Kết quả được trình bày ở bảng 3.5 và biểu đồ hình 3.9
Bảng 3.5: Lượng sinh khối khơ thu được (g), hàm lượng astaxanthin tính trên sinh khối khơ (mg/g) và thể tích canh trường ni cấy (mg/l) ở những nghiệm thức môi
trường khác nhau
Môi
trường
Lượng sinh khối khơ
(g/ lít) Hàm lượng astaxanthin (mg/g) Hàm lượng astaxanthin (mg/l) MT1 1.2670 ± 0.0057 130.83 ± 3.779 165.71 ± 4.040 MT2 1.9420 ± 0.0209 246.82 ± 43.827 479.29 ± 3.464 MT3 2.0670 ± 0.0065 272.64 ± 57.414 563.57 ± 5.196 MT4 3.7430 ± 0.0167 310.48 ± 202.260 1162.14 ± 9.237
47
Hình 3.8: Biểu đồ đánh giá hàm lượng astaxanthin thu được khi nuôi cấy nấm men trên
mơi trường khảo sát có bổ sung đầy đủ và khơng bổ sung đầy đủ khống MgSO4 và KH2PO4. Các giá trị trung bình khác biệt nhau có ý nghĩa với n = 3, p < 0,0001.
Kết quả cho thấy môi trường Hansen có đầy đủ các thành phần khống có hàm
lượng astaxanthin thu được cao nhất. Ngược lại, môi trường Hansen thiếu cả hai thành
phần khống có hàm lượng astaxanthin thu được ít nhất. Và các thành phần khống có
ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp/tích lũy astaxanthin. Do vậy, cần thiết phải
khảo sát nồng độ khoáng MgSO4 và KH2PO4 thích hợp đối với chủng Rhodosporidium
sp.
Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ MgSO4 được thực hiện với kết quả
48
Bảng 3.6: Lượng sinh khối khơ thu được (g), hàm lượng astaxanthin tính trên sinh khối khơ (mg/g) và thể tích canh trường nuôi cấy (mg/l) ở những nồng độ MgSO4
khác nhau
Nồng độ MgSO4 (g/l)
Lượng sinh khối khơ
(g/ lít) Hàm lượng astaxanthin (mg/g) Hàm lượng astaxanthin (mg/l) 1 1.9420 ± 0.0346 196.77 ± 0.356 382.14 ± 7.506 2 3.7490 ± 0.0607 320.59 ± 3.804 1201.43 ± 5.196 3 3.6120 ± 0.0498 321.04 ± 3.145 1159.29 ± 4.621 4 3.7630 ± 0.0053 306.36 ± 2.181 1152.86 ± 9.817 5 3.5240 ± 0.0110 296.12 ± 1.532 1043.57 ± 8.665 6 3.6575 ± 0.0386 318.17 ± 1.619 1163.57 ± 6.351
Hình 3.9: Biểu đồ đánh giá hàm lượng astaxanthin thu được khi nuôi cấy nấm men trên
môi trường Hansen ở những nồng độ MgSO4 nuôi cấy khác nhau. Các chữ cái ở đỉnh cột biểu đồ biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với n = 3, p < 0,05
49
Kết quả cho thấy nồng độ MgSO4 2 g/l thích hợp cho việc nuôi cấy
Rhodosporidium sp. trên môi trường Hansen.
Giữ nguyên giá trị pH, nồng độ D-glucose, nồng độ pepton và nồng độ MgSO4 thích hợp, tiến hành thay đổi nồng độ KH2PO4 để khảo sát ảnh hưởng của thành phần khoáng này đến sự sinh tổng hợp/tích lũy astaxanthin. Kết quả đánh giá hàm lượng
astaxanthin được sinh tổng hợp/tích lũy ở những nồng độ KH2PO4 khác nhau được trình bày theo bảng 3.7 và biểu đồ hình 3.10.
Bảng 3.7: Lượng sinh khối khơ thu được (g), hàm lượng astaxanthin tính trên sinh khối khơ (mg/g) và thể tích canh trường nuôi cấy (mg/l) ở những nồng độ KH2PO4
khác nhau
Nồng độ KH2PO4 (g/l)
Lượng sinh khối
khơ (g/ lít) Hàm lượng astaxanthin (mg/g) Hàm lượng astaxanthin (mg/l) 1 1.8670 ± 0.0037 191.66 ± 2.713 357.86 ± 5.773 2 2.6430 ± 0.0514 295.02 ± 4.427 779.29 ± 3.466 3 3.3320 ± 0.0127 347.92 ± 0.409 1159.29 ± 5.781 4 3.7430 ± 0.0225 310.67 ± 0.599 1162.86 ± 9.238 5 3.7260 ± 0.0035 299.63 ± 2.201 1116.43 ± 9.238 6 3.6670 ± 0.0029 251.07 ± 1.688 920.71 ± 6.929
50
Hình 3.10: Biểu đồ đánh giá hàm lượng astaxanthin thu được khi nuôi cấy nấm men trên