vào ngày thứ 10 và tế bào nang hoàn toàn trưởng thành vào ngày thứ 22 đây cũng chính là thời điểm hàm lượng astaxanthin tích lũy được nhiều nhất. Dựa vào cơng thức 2.2 tính
được hàm lượng astaxanthin chiết được sau 22 ngày stress, kết quả được thể hiện trong
bảng 3.15.
Bảng 3.15: Hàm lượng astaxanthin chiết được sau 22 ngày ủ ở 37 oC Thời gian gây stress 22 ngày
Sinh khối khô (g/l) 0,412 ±0,007
Hàm lượng astaxanthin (µg/g) 26805,06 ± 1457,45
Hàm lượng astaxanthin (µg/l) 11043,68 ± 10,20
Từ đây có thể kết luận, trong các thông số đã khảo sát thì 37 oC là yếu tố hiệu quảđể rút ngắn thời gian tích lũy astaxathin vì hàm lượng astaxanthin thu được đạt tới 2,68 % trọng lượng khô trong điều kiện ni cấy phịng ở thí nghiệm trong 22 ngày. Thời gian tích lũy astaxanthin khi ủ ở 37 oCngắn hơn các nghiệm thức khác vì lúc này tảo chịu sự tác động của 3 yếu tố stress là nhiệt độ, khơng được sục khí và cạn kiệtdinh dưỡng,
nhưng nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất quyết định sự tích lũy astaxanthin vì so với
nghiệm thức đối chứng thì chỉ thêm 1 yếu tố stress là nhiệt độ 37 oC mà thời gian tích lũy 0 ngày 4 ngày 10 ngày
15 ngày 20 ngày 22 ngày
10 µm 10 µm 10 µm
10 µm 10 µm
10 µm
Hình 3.34: Sự thay đổi của tế bào H. pluvialis khi ủ ở 37 oC C
78
astaxanthin đã được rút ngắn khá nhiều. Thời gian bắt đầu tích lũy astaxanthin ở môi trường BG11 khi nuôi ở trạng thái tĩnh là 18 ngày sau stress, trong khi đó chỉ sau 10 ngày ủ ở 37 oC thì q trình tích lũy astaxanthin đã bắt đầu và đến ngày thứ 22 hàm lượng astaxanthin được tích lũy nhiều nhất. Bên cạnh đó gây stress tế bào bằng thời gian chiếu
sáng liên tục 24 giờ/ngày và ánh sáng mặt trời khơng tích hoạt q trình tích lũy astaxanthin, vì vậy có thể kết luận ở 37oC và khơng sục khí có thể sử dụng làm yếu tố rút ngắn thời gian tích lũy astaxanthin ở H. pluvialis.
3.2.3 Ảnh hưởng của sự thiếu hụt dinh dưỡng đến sự tích lũy astaxanthin ở H.
pluvialis
3.2.3.1 Xác định thời gian trưởng thành tế bào nang của H.pluvialis trong môi
trường RM
Khi mật độ tế bào đạt giá trị cao nhất thì tiến hành ly tâm ở 4500 vòng/phút trong 5 phút 25oC, phần tế bào thu được được bổ sung vào môi trường RM và chiếu sáng ở 24 giờ. Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong hình 3.11 và 3.12.
Hình 3.35: Sự thay đổi màu sắc của H. pluvialis khi môi trường thiếu hụt dinh dưỡng
RM Không N Không P Khơng N và P
79
Hình 3.36: Sự thay đổi của tế bào H. pluvialis trong môi trường thiếu hụt dinh dưỡng
(vật kính x40)
Qua kết quả quan sát có thể thấy, sự thiếu hụt nitơ và phospho có ảnh hưởng đến q trình tích lũy astaxanthin trong tế bào H. pluvialis, vào sau 14 ngày gây stress hàm
lượng astaxanthin tích lũy được ở các mơi trường đều ở mức cao điều này được giải thích như sau khi chuyển từ môi trường BG11 sang môi trường RM thì tế bào tảo đã trải qua
một giai đoạn stress vì được chuyển từ mơi trường giàu dinh dưỡng sang môi trường kém
dinh dưỡng hơn, đồng thời mơi trường RM cịn thiếu nitơ và phospho, đây là 2 nguyên tố
quan trọng cần cho quá trình sinh trưởng của tế bào. Vì thế khi thiếu 2 nguyên tố này tế bào sẽ ngừng sinh trưởng và chuyển sang giai đoạn chống chịu và tích lũy astaxanthin.
Nhưng Kết quả quan sát cho thấy hàm lượng astaxanthin vẫn chưa đạt được mức
cao nhất, vì lúc này trong tế bào chưa trưởng thành hoàn toàn, vẫn có sự hiện diện của
chlorophyll trong tế bào chất.
3.2.3.2 Xác định thời gian phát triển thành tế bào nang trưởng thành của H.pluvialis khi được chiếu sáng liên tục 24 giờ/ngày trong môi trường RM với sự thiếu hụt nitơ và phospho RM Không N Không N và P 10 µm 10 µm 10 µm 10 µm 10µ 10µm 10µm 10µm Không P
0 ngày 5 ngày 10 ngày 14 ngày
10µm 10µm 10µm 10µm
10µm 10µm
80
Sau 14 ngày tăng sinh, tế bào H. pluvialis được bổ sung vào môi trường RM với
sự thiếu hụt nitơ, phospho và được chiếu sáng liên tục 24 giờ/ngày, kết quả được thể hiện trong hình 3.37 và 3.38 RM Khơng N Khơng P Khơng N và P RM Không N Không P
0 ngày 3 ngày 7 ngày 10 ngày
0 ngày 3 ngày 7 ngày 10 ngày
10 µm 10 µm 10 µm 10 µm
10 µm 10 µm 10 µm 10 µm
10 µm 10 µm 10 µm 10 µm
Hình 3.37: Sự thay đổi màu sắc của H. pluvialistrong mơi trường thiếu hụt dinh dưỡng
81
Hình 3.38: Sự thay đổi của tế bào H. pluvialistrong môi trường thiếu hụt dinh dưỡng và
chiếu sáng liên tục 24 giờ/ngày (vật kính x40)
Qua kết quả quan sát được thì tế bào tảo trong môi trường RM với sự thiếu hụt nitơ và phospho khi được chiếu sáng 24 giờ/ngày có thời gian tích lũy astaxanthin sớm
nhất (bắt đầu từ ngày thứ 3 của quá trình gây stress astaxanthin đã được tích lũy, sau 10
ngày gây stress tế bào đã phát triển thành nang bào trưởng thành và hàm lượng
astaxanthin tích lũy được là lớn nhất) nên sinh khối của nghiệm thức này được sử dụng
để tách chiết astaxanthin và sử dụng cho các thí nghiệm phía sau. Hàm lượng astaxanthin
chiết được sau 10 ngày gây stress được tính theo cơng thức 2.2, kết quả này thể hiện trong bảng 3.16.
Bảng 3.16: Hàm lượng astaxanthin thu được sau 10 ngày gây stress trong môi trường
RM thiếu nitơ và phospho với thời gian chiếu sáng 24 giờ Thời gian gây stress 10 ngày
Sinh khối khô (g/l) 0,441 ± 0,007
Hàm lượng astaxanthin (µg/g) 26721,96 ± 1380,79
Hàm lượng astaxanthin (µg/l) 11784,38 ± 9,67
Sự tích lũy astaxanthin ở mơi trường thiếu hụt nitơ và phospho là nhanh nhất, kết quả này phù hợp với cơ sở lý thuyết đã có như sau vi tảo sẽ không quang hợp khi môi
trường khơng có nitơ và sự thiếu hụt phospho là một yếu tố quan trọng để kích thích tích
lũy astaxanthin (theo Imamoglu và cộng sự, 2007). Đồng thời kèm theo chiếu sáng liên
tục 24 giờ/ngày đã thêm một yếu tố stress kích hoạt q trình tích lũy astaxanthin nên thời gian tích lũy astaxanthin được rút ngắn đáng kể.
Từ kết quả thu được có thể kết luận trong mơi trường RM thiếu nitơ và phospho
khi chiếu sáng liên tục 24 giờ/ngày là điều kiện hiệu quả nhất để rút ngắn thời gian tích lũy astaxanthin (hàm lượng astaxanthin đạt 2,67 % chỉ sau 10 ngày gây stress). Từ đây có thể hướng tới áp dụng phương pháp này để sản xuất lượng lớn astaxanthin trong thời gian ngắn.
Không N và P
10 µm 10 µm 10 µm
82
3.2.4 Hiệu quả của các phương pháp tách chiết astaxanthin từ vi tảo 3.2.4.1 Hàm lượng astaxanthin thu được từ các phương pháp 3.2.4.1 Hàm lượng astaxanthin thu được từ các phương pháp
Hàm lượng astaxanthin được chiết bằng các phương pháp khác nhau (bảng 3.17)
có sự khác nhau, điều này được thể hiện trực quan bằng đồ thị hình 3.39 và hình 3.40.
Bảng 3.17: Hàm lượng astaxanthin khi chiết bằng bột thủy tinh và DMSO
Mẫu Astaxanthin thu nhận bằng bột thủy tinh
Astaxanthin thu nhận bằng DMSO
Sinh khối khô (mg) 5,05± 0,15 4,95 ± 0,05
Hàm lượng astaxanthin
(µg/g) 11988,11± 217,59 26228,72 ± 175,08 Phần trăm astaxanthin
trong sinh khối khô (%) 1,20± 0,03 2,62 ±0,02
Hình 3.39: Hàm lượng astaxanthin của các mẫu
83
Hình 3.40: Hàm lượng astaxanthin chiết bằng bột thủy tinh (a) và DMSO (b)
Qua kết quả thu được có thể nhận thấy hàm lượng astaxanthin của mẫu được chiết bằng DMSO cao hơn mẫu được chiết bằng thủy tinh, điều này có thể là do trong q trình nghiền sinh khối tảo với bột thủy tinh đã không phá hủy hoàn toàn thành tế bào nên
lượng sắc tố thu được ít hơn.
3.2.4.2 Kết quả định tính astaxanthin từ dịch chiết
Kết quả chạy sắc kí bản mỏng (TLC)
Tiến hành chấm sắc kí theo phương pháp đã trình bày ở trên với mẫu astaxanthin
thương mại và mẫu astaxathin thu bằng DMSO, kết quả được thể hiện trong hình 3.41
Hình 3.41: Sắc kí đồ dưới ánh sáng thường (a) và tia UV (b) của mẫu astaxanthin thương
mại (A) và dịch chiết sắc tố bằng DMSO (B) với hệ dung môi acetone:hexan tỉ lệ 1:4
(a) (b)
(a) Chiết bằng bột thủy tinh (b) Chiết bằng DMSO
84
Từ sắc kí đồ có thể thấy được vạch 1 của 2 mẫu có độ dịch chuyển gần bằng nhau, theo cơng thức 2.1 thì Rf mẫu A = 0,24, Rf mẫu B = 0,27. Từ đây có thể kết luận sắc tố thu
nhận được từ lồi vi tảo ban đầu có sự hiện diện của astaxanthin, ngồi ra cịn có các sắc tố khác do hỗn hợp sắc tố thu được chưa qua bước tinh sạch.
3.2.4.3 Kết quả đo đỉnh bước sóng hấp thụ cực đại
Mẫu astaxanthin chiết được được quét bước sóng từ 350 nm đến 600 nm thu được kết quả như sau (bảng 3.18 và đồ thị 3.4)
Bảng 3.18: Giá trị OD ở các bước sóng khác nhau
Bước sóng (nm) 465 466 467 468 469 470 471 Giá trị OD 1,5741 1,5852 1,5934 1,5937 1,5912 1,5002 1,5872
Hình 3.42: Đỉnh hấp thụ của mẫu astaxanthin chiết được
Từ đồ thị trên có thể thấy đỉnh hấp thụ của mẫu astaxanthin thu được là bước sóng 468 nm, kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Kelly-Harmon (1972) về đỉnh bước
sóng hấp thụ cực đại của astaxanthin trong petrolium ether [10]. Từ đây có thêm dữ kiện
để khẳng định trong dịch chiết sắc tố từ vi tảo H. pluvialis có sự hiện diện của astaxanthin – hợp chất mục tiêu của quá trình tách chiết.
85
3.3 Nghiên cứu quy trình tách chiết b-glucan từ sinh khối nấm men Rhodospridium
sp. và từ bã men bia (Saccharomyces cerevisiae)
3.3.1 Điều kiện thích hợp cho ly trích polysaccharide giàu β-glucan từ tế bào
Rhodosporidium sp.
3.3.1.1 Thời gian thích hợp để ly giải tế bào nấm men Rhodosporidium sp.
Kết quả thu được khi khảo sát ly giải tế bào nấm men bằng NaOH 4%, ở nhiệt độ 50oC, tỷ lệ mẫu:NaOH là 1:10, với các mốc thời gian 0; 3; 6; 9; 12; 15; 18; 21; 24; 27 giờ
được thể hiện ở bảng 3.19.
Bảng 3.19: Hàm lượng protein khi ly giải tế bào nấm men bằng NaOH theo thời gian
Thời gian ly giải (giờ) Hàm lượng protein (mg/ml) 0 1,06 ± 0,03 3 1,19 ± 0,10 6 1,71 ± 0,07 9 2,68 ± 0,12 12 2,69 ± 0,02 15 2,70 ± 0,03 18 2,71 ± 0,11 21 2,71 ± 0,04 24 2,72 ± 0,07 27 2,73 ± 0,01
Dựa vào bảng 3.19, chúng tơi dựng đồ thị hình 3.43 để thấy rõ sự khác biệt hàm
86
Hình 3.43: Hàm lượng protein thủy giải tế bào nấm men bằng NaOH theo thời gian
Qua đồ thị hình 3.43, thấy được lượng protein từ thành tế bào phóng thích ra dịch
tăng dần từ 0 giờ đến 9 giờ, sau 9 giờ hàm lượng protein không thay đổi nhiều. Cụ thể là
1,06mg/mlở 0 giờ, 2,68 mg/ml ở 9 giờ và 2,73mg/ml ở 27 giờ. Chúng tôi nhận thấy được
ở 9 giờ trở về sau lượng protein thành tế bào đã thủy phân ra mơi trường dịch bên ngồi tương đối hết nên từ 9 giờ đến 27 giờ hàm lượng protein thay đổi không nhiều ở các lần đo.
So sánh với kết quả nghiên cứu Arturas Javmen, Saulius Grigiskis, Raimonda Gliebute (2012) thời gian ly giải thành tế bào Actinomyces rutgersensis 88 tối ưu ở 6 giờ [11]Error! Reference source not found.. Nguyên nhân có sự khác biệt này là do sự khác nhau về thành nấm men của các chủng nấm men nghiên cứu.
Vì vậy, chúng tơi quyết định chọn mốc 9 giờ để áp dụng cho việc thủy giải tế bào nấm men để tiết kiệm thời gian.
Với sinh khối nấm men sau khi ly giải, chúng tôi ly tâm và thu được phần dịch nổi và phần tủa. Phần dịch là polysaccharide tan trong kiềm –POLY2, phần tủa là thành tế bào nấm men. Sau khi sấy khô sẽ có số liệu khối lượng khô tuyệt đối được trình bày trong bảng 3.20.
87
Mẫu
Khối lượng mẫu (khô tuyệt đối) (g)
Sinh khối nấm men 10,1282 Thành tế bào nấm men 2,0006
POLY2 0,3863
Từ bảng 3.20, chúng tơi tính được:
· Hiệu suất tách POLY2 trên khối lượng sinh khối khô nấm men = 3,81 % · Hiệu suất thu thành tế bào trên khối lượng sinh khối khô nấm men =19,75 %
3.3.1.2 Nồng độ NaOH thích hợp để ly trích polysaccharide giàu β-glucan
Kết quả thu được khi khảo sát ly trích polysaccharide ở các nồng độ NaOH khảo
sát 0 M - nước cất (đối chứng); 0,5 M; 1 M; 2 M; 3 M; 4 M, nhiệt độ 100oC, thời gian 2 giờ, tỷ lệ mẫu:NaOH là 1:5. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.21, 3.22.
Bảng 3.21: Hàm lượng glucose trong tủa (mg/ml) khi khảo sát nồng độ NaOH ly trích polysaccharide Nồng độ NaOH (M) 0 (ĐC) 0,5 1 2 3 4 Hàm lượng glucose trong tủa (mg/ml) 710,03 ±9,58 657,03 ±18,40 602,89 ±1,70 570,58 ±13,50 681,12 ±5,95 580,78 ±14,05
88
Hình 3.44: Hàm lượng glucose trong tủa (mg/ml) khi khảo sát nồng độ NaOH khi ly trích polysaccharide
Từ biểu đồ hình 3.44, chúng tôi thấy hàm lượng glucose cao ở nước cất là
710,0mg/ml, ở NaOH 0,5M là 657,03 mg/ml và ở NaOH 3M là 681,12mg/ml. Các hàm
lượng glucose đã có sự chênh lệch nhưng cũng chưa đủ để quyết định được nồng độ
NaOH tối ưu. Vì thế, chúng tơi chọn 3 nồng độ đó để xem xét tiếp và chọn ra nồng độ NaOH tối ưu sau khi định lượng protein và hàm lượng protein trong dịch nổi.
Bảng 3.22: Hàm lượng glucose trong dịch (mg/ml) và hàm lượng protein trong dịch (mg/ml) khi khảo sát nồng độ NaOH khi ly trích polysaccharide
Nồng độ NaOH (M) 0 (ĐC) 0,5 1 2 3 4 Hàm lượng protein trong dịch (mg/ml) 14,58 ±2,32 32,18 ±1,22 15,51 ±2,28 14,81 ±2,61 14,12 ±0,61 19,21 ±2,08 Hàm lượng glucose trong dịch (mg/ml) 17,86 ±2,06 29,76 ±3,15 16,67 ±1,19 14,29 ±3,57 5,95 ±1,19 16,67 ±4,29
89
Hình 3.45: Hàm lượng glucose trong dịch (mg/ml) khi khảo sát nồng độ NaOH khi ly trích polysaccharide
Hình 3.46: Hàm lượng protein trong dịch (mg/ml) khi khảo sát nồng độ NaOH khi ly trích polysaccharide
90
Với biểu đồ hình 3.45, khi khảo sát hàm lượng glucose ở các nồng độ NaOH,
chúng tôi thấy rõ sự chênh lệch lớn giữa NaOH 0,5M với các nồng độ còn lại khi khảo sát. Cụ thể hàm lượng glucose là ở NaOH 0,5 M là 29,76 mg/ml, và nồng độ 3M là 5,95 mg/ml, ở khảo sát với nước cất là 17,86 mg/ml.
Với biểu đồ hình 3.46, khi khảo sát hàm lượng protein ở các nồng độ NaOH có sự chênh lệch lớn giữa NaOH 0,5M với các nồng độ còn lại khi khảo sát. Cụ thể hàm lượng protein ở NaOH 0,5 M là 32,18 mg/ml, và các nồng độ 3M là 14,12 mg/ml, ở khảo sát với nước cất là 14,58mg/ml.
Tổng kết kết quả của 3 biểu đồ trên,chúng tôi thấy nồng độ NaOH 0,5M là nồng
độ tối ưu để ly trích β-glucan. Điều này giải thích được là khi đến nồng độ tối ưu thì sẽ
giúp phá vỡ các liên kết các phần trong tế bào, bằng chứng là nó sẽ phóng thích một
lượng lớn chitin, protein và manoprotein. Nhưng thành tế bào có một lượng
polysaccharide nhất định, khi nồng độ NaOH cao, có khả năng phá vỡ cấu trúc polysaccharide nên hàm lượng glucose và protein giảm.
Tương tự nghiên cứu của Arturas Javmen và các cộng sự (2012) chỉ ra rằng nồng độ NaOH tối ưu là 0,5M cao hơn NaOH 1 M, 2 M, 3 M, 4 M, 5M [11].
Vì vậy, chúng tơi quyết định chọn NaOH 0,5M để tách chiết polysaccharide.
3.3.1.3 Thời gian thích hợp để ly trích polysaccharide giàu β-glucan
Kết quả thu được khi khảo sát ly trích glucan ở các mốc thời gian khảo sát 0 giờ, 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, cùng nhiệt độ 100oC, nồng độ NaOH 0,5M, tỷ lệ mẫu:NaOH là 1:5. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.23, 3.24.
Bảng 3.23: Hàm lượng glucose trong tủa (mg/ml) khi khảo sát thời gian ly trích polysaccharide
Thời gian ly trích (giờ) 0 (ĐC) 1 2 3 4 5
Hàm lượng glucose trong tủa (mg/ml) 966,57 ±18,48 589,29 ±28,35 664,29 ±12,37 843,96 ±20,74 947,53 ±7,27 936,81 ±6,88
91
Hình 3.47: Hàm lượng glucose trong tủa (mg/ml) khi khảo sát thời gian ly trích polysaccharide
Từ biểu đồ hình 3.47, tơi nhận thấy được hàm lượng glucose có sự khác biệt giữa mốc 0 giờvà các nồng độ cịn lại. Trong khi đó, hàm lượng glucose các mốc thời gian còn lại trong tủa tăng dần khi tăng thời gian ly trích từ 1 giờ đến 4 giờ và không thay đổi
nhiều ở mốc 5 giờ. Cụ thể hàm lượng glucose định lượng được trong tủa như sau: ở 0 giờ là 966,57mg/ml, 1 giờ là 589,29mg/ml, ở 4 giờ là 947,53mg/ml và ở 5 giờ là