CHƯƠNG II : NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2 Nội dung 2 Nghiên cứu các điều kiện để nuôi cấy vi tảo Haematococcus pluvialis
sinh tổng hợp nhiều astaxanthin ở điều kiện phịng thí nghiệm
Chủng tảo Haematococcus pluvialis có khả năng sinh tổng hợp astaxanthin được cung cấp bởi Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II,116 Nguyễn Đình Chiểu, phường
Đa Kao, quận 1, TP. Hồ Chí Minh.
Astaxanthin chuẩn được sản xuất bởi Cơng ty DSM Nutritional Products Vietnam Ltd. Hóa chất dùng cho phần phân tích vi sinh. Mơi trường BG11 [4], môi trường RM
[40], môi trường F2 [21]. Bảng 2.1: Thành phần môi trường BG11, RM, F2 Thành phần môi trường Môi trường BG11(mg/l) RM(mg/l) F2 (g/l) NaNO3 1500 300 7.5 NaH2PO4 - - 5,65 K2HPO4 400 80 - KH2PO4 - 20 -
22
MgSO4.7H2O 750 10 -
CaCl2.2H2O 36 58,5 -
Acid citric 6 - -
Ammonium ferric cirate 6 - -
EDTA-Na2 100 - 4,16 EDTA - 7,5 - Na2CO3 200 - - NaCl - 20 - H3BO3 2,86 0,3 - MnCl2 1,81 - 0,18 MnSO4.H2O - 1,5 - ZnSO4.7H2O 0,22 0,1 0,022 Na2MoO4.2H2O 0,39 - 0,006 (NH4)Mo7O24.4H2O - 0,3 - CuSO4.5H2O 0,08 0,08 0,01 Co(NO3)2.6H2O 0,05 0,2 - CoCl2.6H2O - - 0,01 FeCl3.6H2O - 17 3,15 Vitamine B12 0,0005 (g/l) Vitamine B1 0,1 (g/l) Biotin 0,0005 (g/l)
23 Nếu là môi trường rắn thì có bổ sung thêm agar 25g/l.
2.2.1 Phương pháp nuôi cấy
Nguyên tắc
Khi điều kiện môi trường thuận lợi tế bào H.pluvialis phân chia nhanh chóng,
ngược lại khi môi trường chuyển sang hướng bất lợi thì tế bào ngừng phân chia và
chuyển sang giai đoạn tích lũy các hợp chất thứ cấp trong đó astaxanthin là hợp chất
chiếm hàm lượng cao nhất [19]. Vì vậy, để tăng sinh tế bào thì các yếu tố như nhiệt độ,
ánh sáng, độ thống khí và hàm lượng dinh dưỡng cần được đảm bảo ở mức tối ưu, khi
chuyển sang giai đoạn kích thích q trình tích lũy astaxanthin thì các yếu tố trên sẽ được
điều chỉnh ra khỏi giới hạn tối ưu.
Mơ hình ni cấy
Q trình tăng sinh vi tảo H. pluvialis được thực hiện trong các chai duran 1 lít có ống dẫn khí vào và ra. Khí sau khi bơm vào được đi qua hệ thống lọc bụi và
syring lọc khuẩn, cuối cùng được đi vào môi trường nuôi tảo bằng các ống thủy tinh đã hấp khử trùng. Sử dụng hệ thống đèn led để chiếu sáng với cường độ ánh sáng là 2,02 Klux (hình 2.3).
Hình 2.3. Mơ hình tăng sinh sinh khối H. pluvialis
Lọc bụi Syring0, 2µm Đèn led Dụng cụ điều chỉnh khí
24
Q trình gây stress được thực hiện ở trạng thái tĩnh trong erlen 250 ml và 50 ml với thời gian chiếu sáng khác nhau tùy thuộc vào các nghiệm thức.
Điều kiện nuôi cấy
H. pluvialis là loài vi tảo khá nhạy cảm với những thay đổi của mơi trường
nên trong q trình ni cấy những thơng số sau cần được kiểm sốt chặt chẽ (bảng 2.2)
Bảng 2.2: Một số thông số ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của H.pluvialis
Nhiệt độ 25 oC
Cường độ ánh sáng 2 Klux
Thời gian chiếu sáng 12 giờ sáng : 12 giờ tối Tốc độ khí Đảo đều tảo
Hàm lượng các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng của H.pluvialis thấp và sẽ
có hiện tượng kết tủa nếu áp dụng cách pha thơng thường vì vậy cần pha môi trường ở
dạng stock để đem lại hiệu quả tốt nhất cho các thí nghiệm. Thể tích giống ban đầu được bổ sung một lượng từ 10 % đến 20 % thể tích cần có.
2.2.2 Xác định đường cong sinh khối khô
Nguyên tắc
Ở những môi trường khác nhau tế bào sinh trưởng ở một tốc độ khác nhau nên lượng sinh khối thu được sẽ khác nhau.
Cách tiến hành
- Dựng đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD610 nm và trọng lượng sinh khối khơ của tế bào (mgml)
Pha lỗng dịch nuôi vi tảo trong môi trường BG11, RM, F2 sao cho độ đục
ở OD610 nmđạt giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5.
Tiến hành ly tâm ở 4500 vòng/phút trong 5 phút thu sinh khối vi tảo của
từng môi trường ở các giá trị OD nói trên, mỗi nghiệm thức thực hiện 3 lần để lấy giá trị trung bình.
25
Sau đó sấy khơ lượng sinh khối thu được trong 105oC trong 2 giờ và cân đến khi trọng lượng không đổi. Thực hiện 3 lần sấy và cân sinh khối sau sấy.
Tính trọng lượng sinh khối khơ trên 1ml mơi trường (mg/ml).
Dựng đường tương quan tuyến tính giữa các giá trị OD610và trọng lượng tế bào khô (mg/ml).
- Xác định đường cong sinh khối khô
Nuôi vi tảo ở điều kiện tối ưu và đo OD sau mỗi 24 giờ đến khi giá trị OD giảm thì dừng. Từ giá trị OD suy ra trọng lượng sinh khối khơ dựa vào đường tương quan tuyến tính. Vẽ đồ thị đường cong sinh khối khô.
2.2.3 Xác định đường cong tăng trưởng
Nguyên tắc
Sự sinh trưởng của vi sinh vật trải qua các pha là tiềm tàng, lũy thừa, ổn định và suy tàn. Mật độ tế bào ở những pha khác nhau thì khác nhau, điều này được thể
hiện qua độ hấp thu ánh sáng khi được đo ở cùng một bước sóng.
Cách tiến hành
- Dựng đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD610 nm và mật độ tế bào log (N/ml)
Pha lỗng dịch ni vi tảo trong môi trường được xác định là tối ưu sao cho
độ đục ở OD610đạt giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5.
Tiến hành đếm trực tiếp tế bào vi tảo bằng buồng đếm hồng cầu ở các nồng
độ có các giá trị OD kể trên, thực hiện đếm 2 lần để lấy giá trị trung bình.
Tính số lượng tế bào trên 1ml mơi trường (N/ml).
Dựng đường tương quan tuyến tính giữa các giá trị OD610và mật độ tế bào log (N/ml) [46].
- Xác định đường cong tăng trưởng
Nuôi vi tảo ở các điều kiện tối ưu và đo OD610 sau mỗi 24 giờ đến khi thấy OD giảm thì dừng. Từ giá trị OD suy ra mật độ tế bào dựa vào đường tương quan tuyến tính.
26
Vẽ đồ thị đường cong tăng trưởng log (N/ml).
2.2.4 Xác định thời điểm dừng quá trình gây stress
Nguyên tắc
Tế bào vi tảo chuyển sang giai đoạn bào nang khi gặp điều kiện bất lợi, lúc này q trình tích lũy astaxanthin bắt đầu diễn ra trong nhân tế bào, khi trở thành bào
nang trưởng thành thì tế bào có màu đỏ [29].
Cách tiến hành
Sử dụng kính hiển vi để theo dõi sự thay đổi kích thước, hình thái và màu sắc trong tế bào H.pluvialis từ khi bắt đầuquá trình gây stress.
Quá trình này sẽ dừng lại khi tế bào phát triển thành bào nang trưởng thành.