Như vậy, β-glucan có ảnh hưởng đến tỉ lệ sống chết của cá dĩa khi cá bị nhiễm
khuẩn. Kết quả có thể do β-glucan làm tăng khả năng miến dịch của cá, giúp cá có khả
năng kháng lại với vi khuẩn gây bệnh Aeromonas hydrophila. Điều này chứng tỏ, β-
glucan có khả năng giúp cá phịng bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila . Liều bổ
sung thích hợp cho cá khi kết hợp với β-glucan là 1%, đồng thời việc tiếp tục bổ sung β- glucan sau khi cá bị nhiễm khuẩn khơng có thay đổi nhiều so với nghiệm thức không bổ sung β-glucan sau khi cá bị nhiễm khuẩn.
Từ kết quả thử nghiệm trên cá xác định được chế phẩm bổ sung cho thức ăn cho cá có thể làm đậm màu của cá và làm tăng hệ miễn dịch cụ thể là tăng tổng số tế bào bạch cầu ở cá là hàm lượng astaxanthin và β-glucan lần lượt là 90mg/kg thức ăn và 10g/kg
thức ăn. Từ đây có thể tạo ra chế phẩm hỗn hợp chứa cả hai chất trong cùng 1 chế phẩm bổ sung cho thức ăn cho cá dĩa có chứa đồng thời astaxanthin và β-glucan như hàm lượng
như trên. Hiện nay trên thị trường là các chế phẩm thô nên sản phẩm rẻ hơn, trong khi
sản phẩm của đề tài là tách chiết so với chất chuẩn cùng đặc tính rẻ hơn rất nhiều. Tuy nhiên sản phẩm đề tài không tan trong nước là đặc tính đúng của astaxanthin, cịn thị
142
Chương 4 −KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận
Hồn thiện quy trình ni cấy chủng nấm men Rhodosporidium sp. theo quy mơ pilot bằng hệ thống ni cấy dung tích 2 l trên mơi trường rỉ đường đã xử lý.
Đường cong tăng trưởng, thu nhận sinh khối khô và astaxanthin tối ưu khi nuôi
cấy với tỷ lệ giống bổ sung 10% vào thời điểm 74 giờ, cụ thể hàm lượng astaxanthin là 2309,17µg/l và trọng lượng sinh khối khô thu được là 6,1696 g/l hay 374,29 µg/g sinh khối khơ.
Qua các kết quả thu được có thể kết luận mơi trường tăng sinh tốt nhất cho loài H.
pluvialis ở điều kiện phịng thí nghiệm đã thực hiện là BG11 ở điều kiện sục khí với cường độ ánh sáng 2Klux, thời gian chiếu 12 giờ ở 25oC trong thời gian 14 ngày.
Trong giai đoạn tạo astaxanthin:
- Đối với môi trường BG11 ni tĩnh thì từ 18 ngày trở đi mới có sự tích lũy astaxanthin. Khi tăng nhiệt độ lên 37oC thì thời gian bắt đầu tích lũy là ngày thứ
10 và đạt 2,68% ở ngày thứ 22.
- Đối với môi trường RM khơng có nitơ và phospho với thời gian chiếu sáng 24
giờ/ngày hàm lượng astaxanthin tích lũy chiếm tới 2,67% trọng lượng tế bào chỉ sau 10 ngày gây stress.
Chúng tôi đã xác định được quy trình tách chiết astaxanthin từ Rhodosporidium
sp.:
· Tế bào nấm men sau khi rửa sạch trong đệm PBS
· Ly tâm, thu sinh khối, xử lý sinh khối với HCl trong 45 phút · Bổ sung dung môi ethylete tách chiết
· Lắc hỗn hợp chiết liên tục ở tốc độ 200 vòng/phút trong 1 giờ, ở 30oC · Ly tâm thu dịch nổi có chứa astaxanthin
· Đuổi dung môi, sấy khô chân không và thu nhận chế phẩm astaxanthin
Chúng tôi cũng đã xác định được quy trình tách chiết astaxanthin từ tảo
Haematococcus pluvialis với hàm lượng astaxanthin thu được trong mẫu chiết với
DMSO cao hơn mẫu chiết bằng bột thủy tinh.
· Xây dựng được quy trình tách chiết b-glucan từ sinh khối nấm men
143
Ly giải thành tế bào hoàn toàn bằng NaOH 4% nhiệt độ 50oC thời gian 9 giờ sau khi loại sắc tố.
Điều kiện thích hợp thu nhận glucan từ thành tế bào nấm men bằng NaOH 0,5M, thời
gian 4 giờ, nhiệt độ 100oC, tỷ lệ mẫu:NaOH là 1:5. Hàm lượng β-glucan là 64,87 %.
Hiệu suất của cả quy trình thí nghiệm hàm lượng β-glucan của mẫu POLY1 tính trên khối lượng sinh khối khơ nấm men là 9,31 %.
· Xây dựng được quy trình tách chiết b-glucan từ sinh khối nấm men nấm men bia và men bánh mì:
Quy trình thích hợp để tách β-glucan từ vách tế bào nấm men cho cả men bia và
men bánh mì là NaOH 1M, đun ở 1000C trong 4 giờ với tỉ lệ NaOH (ml) : vách tế bào (g) = 1 : 5. Dựa vào hiệu suất tách chiết và phần trăm β-glucan có trong polysaccharide 1 (men bia) và polysaccharide 3 (men bánh mì).
Sau ba tháng thí nghiệm, kết quả cho thấy màu sắc của cá dĩa đỏ ở các nghiệm
thức có sự khác nhau rõ rệt ở nồng độ 90mg/kg thức ăn. Cá dĩa có màu sắc đậm nhất ở
nghiệm thức chế phẩm thương mại với số điểm trung bình là 28,25; kế đến là nghiệm
thức astaxanthin tách chiết tương ứng với số điểm 26,23; nghiệm thức đối chứng không sử dụng astaxanthin cho kết quả màu sắc trên da cá dĩa nhạt nhất với 20,48 điểm.
Sau 30 ngày cho cá ăn thức ăn có bổ sung β-glucan với các nồng độ khác nhau
0,1%, 0,5% và 1 %, ở nghiệm thức cho ăn ở nồng độ 1% có khả năng kích thích miễn dịch cho cá dĩa thơng qua hàm lượng tế bào bạch cầu trên 3500 tế bào trên ul. Ngồi ra cũng cho thấy β-glucan có khả năng kích thích tăng sức đề kháng hơn là trị bệnh.
Từ kết quả thử nghiệm trên cá xác định được chế phẩm bổ sung cho thức ăn cho cá có thể làm đậm màu của cá và làm tăng hệ miễn dịch cụ thể là tăng tổng số tế bào bạch cầu ở cá là hàm lượng astaxanthin và β-glucan lần lượt là 90mg/kg thức ăn và 10g/kg thức ăn bổ sung cho cá dĩa vừa tăng màu sắc an toàn cho cá và tăng sức đề kháng cho cá.
4.2. Đề nghị
144
Từ các nghiên cứu của đề tài chúng tôi mong muốn được nâng quy mô nuôi cấy nấm men và tảo và Nghiên cứu tạo astaxanthin tan trong nước thay vì hiện nay tan trong dầu.
Thử nghiệm gây đột biến nấm men Rhodosporidium sp nhằm nâng cao hàm
lượng astaxanthin tích lũy.
Thử nghiệm ni tảo, nấm men trong điều kiện ánh sáng LED nhằm xem xét khả năng kích thích tạo astaxanthin của các ánh sáng đơn sắc.
145
Tài liệu tham khảo
Tiếng Việt
1. Trịnh Thị Lan Chi. 2010. Thử nghiệm bổ sung sắc tố astaxanthin và canthaxanthin vào thức ăn cho cá chép Nhật (cá chép koi - Cyprinus carpio). Đề
tài cấp thành phố. Sở Khoa Học và Công nghệ Tp.HCM.
2. Lê Thanh Hùng, 2008. Thức ăn và dinh dưỡng thủy sản. NXB Nông Nghiệp
Tp.HCM
3. Bùi Thị Phương Khánh. 2011. Phân lập, tuyển chọn, định danh một số chủng nấm
men có khả năng sinh tổng hợp astaxanthin. Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường
ĐHKHTN, ĐHQG Tp.HCM.
4. Nguyễn Đức Lượng, 2002. Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 2, thí nghiệm vi sinh vật học. NXB Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh.
5. Trình Mai Duy Lưu, Lê Hồng Phúc, Kiều Phương Nam, Ngô Đại Nghiệp, 2010.
Sàng lọc và nghiên cứu đặc điểm các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin. Tạp chí cơng nghệ sinh học, 8, 3B, 1601-1608.
6. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, tr. 213-426.
7. Phùng Văn Tâm, Bùi Thị Phương Khánh, Ngô Đại Nghiệp, 2012. Bước đầu khảo
sát quy trình ni cấy chủng nấm men Rhodosporidium toruloides để thu nhận Astaxanthin. Khóa luận cử nhân ngành Sinh học, Trường ĐHKHTN, ĐHQG
Tp.HCM, 7/2012.
8. Tống Kim Thuần, Trần Thanh Thủy, 2007. Xác định hàm lượng sắc tố astaxanthin
trong tế bào của chủng nấm men Phaffia rhodozyma NT5 được sử dụng lam thức
ăn bổ sung cho ni trồng thủy sản. Tạp chí sinh học, 29,1, 82 - 88.
9. Tống Kim Thuần, Trần Thanh Thủy, Phạm Công Hoạt. 2006. Phân loại đến lồi
chủng nấm men NT5 có khả năng tổng hợp carotenoid astaxanthin. Tạp chí cơng
146
Tiếng Anh
10. An G.H.(2001). Improved growth of the red yeast, Phaffia rhodozyma
(Xanthophyllomyces dendrorhous), in the presence of tricarboxylic acid cycle intermediates. Biotechnology Letters, 23: 1005 - 1009.
11. Arturas Javmen, Saulius Grigiskis, Raimonda Gliebute, 2012. β-glucan extraction
from S. cerevisiae yeast using Actinomyces rutgersensis 88 yeast lyzing enzymatic complex. Biologija, 58 (2):51 –59.
12. Bhosale, P.; Bernstein, P.S. 2005. Microbial xanthophylls. Appl Microbiol
Biotechnol, 68: 445 - 455.
13. Capelli, B.; Cysewski, G. 2007. Differences between Natural Astaxanthin and Synthetic Astaxanthin 97-107.
14. Cifuentes, A.S.; González, M.A.; Vargas, S.; Hoeneisen, M.; González, N. 2003.
Optimization of biomass, total carotenoids and astaxanthin production in Haematococcus pluvialis Flotow strain Steptoe (Nevada, USA) under laboratory conditions. Biol Res 36: 343 - 357.
15. Eaton,L., Clezy,K; Snellgrove, D.; Sloman,K. (2016), The behavioural effects of supplementing diets with synthetic andnaturally sourced astaxanthin in an ornamental fish (Puntius titteya), Applied Animal Behaviour Science 182, pp.
94–100
16. Ellis, A. 1990. Lysozyme assay. p: 101-103. In: Stolen J.S., D.P. Fletcher, B.S.
Anderson, and B.S. Robertson (Eds). Techniques in fish immunology. USA: SOS Publication.
17. Eonseon, J.; Lee, C.G.; Polle, J.E.W. 2006. Secondary Carotenoid Accumulation
in Haematococcus (Chlorophyceae) biosynthesis, regulation, and biotechnology.
J. Microbiol. Biotechnol. 16 (6), 821 – 831.
18. Fleming M., Kawakami, 1977. Studies of the fine structure of β-D-glucan of
147
19. Gina Marinescu, Antoneta Stoicescu, 2009. Researches concerning the preparation
of spent brewer’s yeast β-glucans. Journal of Agroalimentary Processes and
Technologies 15(4): 547-553.
20. Goodwin, T.W., (1984),The biochemistry of carotenoids, 2nd ed. Animals, vol. II. Chapmanand Hall, London (224 pp.).
21. Guillard R., Ryther J. (1962). Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotellanana Hustedt and Detonula confervaceae (Cleve) Gran. Can Journal of
Microbiology. 8: 229-239.
22. Gupta, S. K., Jha, A. K., Pal, A. K., and Venkateshwarlu, G.,(2007), Use natural carotenoid for pigment in fish,Natural product radiance, Vol 6(1), pp. 46-49, Central Institute of Fisheries Education, Marahashtra, Indian.
23. Harry E. Ensley, Brian Tobias, Henry A. Pretus, Rose B. McNamee, Ernest L. Jones, I. William Browder, David L. Williams, 1993. NMR spectral analysis of a water-insoluble ( 1→3)-β-D-glucan isolated from Saccharomyces cerevisiae,
Carbohydrate Research 258, 307-311
24. Hu, C.M.; Zhao, X.; Zhao, J.; Wu, S.G.; Zhao, Z. K. 2009. Effects of biomass hydrolysis by-products on oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides.
Bioresource Technology 100, 4843–4847.
25. Johnson, E.A. 2003. Phaffia rhodozyma: colorful odyssey. Int Microbiol, 6: 169 - 174.
26. Jørgensen, J. B.; Robertsen, B. 1995. Yeast β-glucan stimulates respiratory burst
activity of Atlantic salmon (Salmo salar L.) macrophages. Developmental &
Comparative Immunology. 19,1, 43–57.
27. Kelley, C.E.; Harmon, A.W. 1972. Method of determining carotenoid contents of
Alaska pink shrimp and representative valves for several shrimp products. Fishery
Bulletin, 70, 111 - 113.
28. Kim J.H.; Kim C.W.; Chang, H.I. 2004. Screening and characterization of red
yeast anthophyllomyces dendrorhous mutants. J. Microbiol Biotechnol, 14(3): 570
148
29. Kobayshi M. (1997). Morphological changes in the life cycle of thegreen alga
Haematococcus pluvialis. Journalo Fermentatioann Bioengineering. 84:94-97.
30. Liu, X.; Osawa, T. 2007. Cis astaxanthin and especially 9-cis astaxanthin exhibits
a higher antioxidant activity in vitro compared to the all-trans isomer.
Biochemical and Biophysical Research Communications, 357: 187 – 193.
31. Livengood, E. J.; Ohs, C. L. and Chapman, F. A. 2009. Candidate Species for Florida Aquaculture: Discus Symphysodon spp., a Profitable but Challenging Species for Florida Aquaculture. Institute of Food and Agricultural Sciences,
University of Florida.
32. Lovell T., 1998. Nutrition and feeding of fish. 2nd Edition, Kluwer Academic Publishers, USA, 125.
33. Lukács, G.Y.; Linka, B.; Nyilasi, I. 2006. Phaffia rhodozyma and
Xanthophyllomyces dendrorhous: astaxanthin-producing yeasts of
biotechnological importance. Acta Alimentaria, 35 (1): 99 - 107.
34. Megazyme, Mushroom and yeast beta-glucan – assay procedure (K-YBGL
04/2008), Megazyme International Ireland Ltd., Co.Wicklow, Ireland, 11p.
35. Moriel, D.G.; Chociai, M.B.; Machado, I.M.P.; Fontana, J.D.; Bonfim, T.M.B. 2005. Effect of feeding methods on the astaxanthin production by Phaffia rhodozyma in fed-batch process. Braz. Arch. Biol. Technol, 48 (3): 397 - 401.
36. Obach, A., C. Quentel, and L.F. Bandin. 1993. Effects of alpha-tocopherol and dietary oxidized fish oil on the immune response of sea bass Dicentrarchus labrax.
Dis. Aquat. Org. 15:175-185.
37. Paglia, D.E., and W.N. Valentine. 1967. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. The Journal of
laboratory and clinical medicine 70:158-169.
38. Paripatananont, T.; Tangtrongpairoi, J.; Sailasuta, A.; Chansue, N. 1999. Effect of
Astaxanthin on the pigmentation of goldfish Carassius auratus. Journal of the
149
39. Robertsen, B.; Rorstad, G.; Engstad, R.; Raa, J. 1990. Enhancement of non- specific disease resistance in Atlantic salmon, Salmo salar L., by a glucan from Saccharomyces cerevisiae cell walls. Journal of Fish Diseases, 13, 5, 391–400. 40. Rudic V., Dudnicenco T., (2000): MD Patent Nr. A 2000 0154.
41. Stanier R.Y, Kunisawa R., Mandel M., CohenBazire G. (1971).Purification and properties of unicellular bluegreen algae (Order Chroococcales).Bacteriology
review.35: 171205.
42. Torrissen, O.J., Hardy, R.W., Shearer, K.D., Scott, T.M., Stone, F.E., (1990), Effects of dietarycanthaxanthin level and lipid level on apparent digestibility coefficients for cantha-xanthin in rainbow trout (Oncorhynchus
mykiss),Aquaculture 88, pp. 351–362.
43. Udomkusonsri, P. 2003. Pathogenesis of the acute ulceration respone (AUR) in
fish. The requirements for the degree of doctor of philosophy, North Carolina
State University, pages 2-9.
44. Wang, C.; Armstrong, D.W.; Chang, C-D. 2008. Rapid baseline separation of enantiomers and a mesoform of all-trans-astaxanthin, 13-cis astaxanthin, adonirubin, and adonixanthin in standards and commercial supplements. Journal
of Chromatography A, 1194, 172–177.
45. Wang, Q.; Guo, F. J.; Rong, Y.J.; Chi, Z. M. 2012. Lipid production from hydrolysate of cassava starch by Rhodosporid ium toruloides 21167 for biodiesel making. Renewable Energy 46, 164-168.
46. Wattley, J. 1985. Jack Wattley's Handbook of Discus. T.F.H. Publications.
47. Wu, S.G.; Hu, C.M.; Zhao, G.X.; Zhao, Z. K. 2010. Phosphate-limitation mediated lipid production by Rhodosporidium toruloides. Bioresource Technology
101, 6124–6129.
48. Yang CC, Chen SN, Lu CL, Chen S, Lai KC, et al. (2014) Effect of Mushroom Beta Glucan (MBG) on Immune and Haemocyte Response in Pacific White Shrimp (Litopenaeus vannamei). J Aquac Res Development 5: 275.
49. Yeh, S.P.; Chang, C.Y.; Liu, C.H. và Cheng, W.C. 2008. Dietary sodium alginate
150
Iridovirus, and juvenile non-specific immune responses of the orange-spotted grouper, Epinephelus coioides. Fish & Shellfish Immunology 25:19-27.
50. Yoshida, T.; Kruger, R.; Inglis, V. 1995. Augmentation of non-specific protection
in African catfish, Clarias gariepinus (Burchell), by the long-term oral
PHỤ LỤC
i
MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC ........................................................................................................................ i
DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................................... ii
DANH SÁCH HÌNH VÀ SƠ ĐỒ ....................................................................... iii
QUY TRÌNH NI CẤY Rhodosoridium sp. ............................................................. 1
QUY TRÌNH NI CẤY TẢO Haematococcus pluvialis ........................................... 4
QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ASTAXANTHIN từ Rhodosporidium sp. .................... 7
QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ASTAXANTHIN TỪ VI TẢO Haematococcus pluvialis ........
........................................................................................................................................... 9
QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT β-GLUCAN TỪ THÀNH TẾ BÀO NẤM MEN Rhodosporidium sp. ........................................................................................................ 12
QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT β-GLUCAN TỪ THÀNH TẾ BÀO NẤM MEN BIA VÀ NẤM MEN BÁNH MÌ ........................................................................................... 14
ii
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng P1: Thành phần môi trường BG11, RM ............................................................. 6 Bảng P2: Hiệu suất thu được β-glucan ........................................................................ 15
iii
DANH SÁCH HÌNH VÀ SƠ ĐỒ
Trang
Hình P1: Mơ hình ni cấy nấm men 2 lít ....................................................................... 1
Sơ đồ P1: Quy trình ni cấy Rhodosoridium sp. trong hệ thống pilot 2 lít .................... 2
Sơ đồ P2: Quy trình ni cấy tảo Haematococcus pluvialis ............................................ 4
Sơ đồ P3: Quy trình tách chiết astaxanthin từ Rhodosporidium sp. ................................ 7
Sơ đồ P4: Quy trình thu nhận astaxanthin từ tảo Haematococcus pluvialis .................... 9
Sơ đồ P5: Quy trình khảo sát ly trích β-glucan từ Rhodosporidium sp. ......................... 12
Sơ đồ P6: Quy trình khảo sát ly trích β-glucan từ nấm men bia và nấm men bánh mì ......
1
QUY TRÌNH NI CẤY Rhodosporidium sp. 1.1 Hệ thống ni cấy pilot 2 lít:
Khi khí được đưa từ máy bơm khí vào ống dẫn, được cản bụi và một số thành phần
nhờ bông không thấm, tiếp tục sát khuẩn qua dung dịch KMnO4 N/50 và được bẫy tại
một erlen - không để dung dịch KMnO4 đi vào thiết bị, được lọc ở syring lọc khí với kích
thước lỗ 0,2 µm rồi mới đưa vào thiết bị. Lượng khí cho vào hệ thống đủ mạnh để làm
xáo trộn dung dịch tạo điều kiện vi sinh vật có thể phát triển tốt ở điều kiện hiếu khí.
2
1.2 Ni Rhodosporidium sp. trên hệ thống pilot 2L
Sơ đồ P1: Quy trình ni cấy Rhodosporidium sp. trong hệ thống pilot 2 lít
Sinh khối khơ nấm men
Rhodosporidium sp. sấy khô
Thông số nuôi cấy: - Urea: 0.5g/l