21
Hình 2.2: Mơ hình ni cấy nấm men 10 lít
2.2 Nội dung 2. Nghiên cứu các điều kiện để nuôi cấy vi tảo Haematococcus pluvialis
sinh tổng hợp nhiều astaxanthin ở điều kiện phịng thí nghiệm
Chủng tảo Haematococcus pluvialis có khả năng sinh tổng hợp astaxanthin được cung cấp bởi Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II,116 Nguyễn Đình Chiểu, phường
Đa Kao, quận 1, TP. Hồ Chí Minh.
Astaxanthin chuẩn được sản xuất bởi Cơng ty DSM Nutritional Products Vietnam Ltd. Hóa chất dùng cho phần phân tích vi sinh. Mơi trường BG11 [4], mơi trường RM
[40], môi trường F2 [21]. Bảng 2.1: Thành phần môi trường BG11, RM, F2 Thành phần môi trường Môi trường BG11(mg/l) RM(mg/l) F2 (g/l) NaNO3 1500 300 7.5 NaH2PO4 - - 5,65 K2HPO4 400 80 - KH2PO4 - 20 -
22
MgSO4.7H2O 750 10 -
CaCl2.2H2O 36 58,5 -
Acid citric 6 - -
Ammonium ferric cirate 6 - -
EDTA-Na2 100 - 4,16 EDTA - 7,5 - Na2CO3 200 - - NaCl - 20 - H3BO3 2,86 0,3 - MnCl2 1,81 - 0,18 MnSO4.H2O - 1,5 - ZnSO4.7H2O 0,22 0,1 0,022 Na2MoO4.2H2O 0,39 - 0,006 (NH4)Mo7O24.4H2O - 0,3 - CuSO4.5H2O 0,08 0,08 0,01 Co(NO3)2.6H2O 0,05 0,2 - CoCl2.6H2O - - 0,01 FeCl3.6H2O - 17 3,15 Vitamine B12 0,0005 (g/l) Vitamine B1 0,1 (g/l) Biotin 0,0005 (g/l)
23 Nếu là mơi trường rắn thì có bổ sung thêm agar 25g/l.
2.2.1 Phương pháp nuôi cấy
Nguyên tắc
Khi điều kiện môi trường thuận lợi tế bào H.pluvialis phân chia nhanh chóng,
ngược lại khi môi trường chuyển sang hướng bất lợi thì tế bào ngừng phân chia và
chuyển sang giai đoạn tích lũy các hợp chất thứ cấp trong đó astaxanthin là hợp chất
chiếm hàm lượng cao nhất [19]. Vì vậy, để tăng sinh tế bào thì các yếu tố như nhiệt độ,
ánh sáng, độ thống khí và hàm lượng dinh dưỡng cần được đảm bảo ở mức tối ưu, khi
chuyển sang giai đoạn kích thích q trình tích lũy astaxanthin thì các yếu tố trên sẽ được
điều chỉnh ra khỏi giới hạn tối ưu.
Mơ hình ni cấy
Quá trình tăng sinh vi tảo H. pluvialis được thực hiện trong các chai duran 1 lít có ống dẫn khí vào và ra. Khí sau khi bơm vào được đi qua hệ thống lọc bụi và
syring lọc khuẩn, cuối cùng được đi vào môi trường nuôi tảo bằng các ống thủy tinh đã hấp khử trùng. Sử dụng hệ thống đèn led để chiếu sáng với cường độ ánh sáng là 2,02 Klux (hình 2.3).
Hình 2.3. Mơ hình tăng sinh sinh khối H. pluvialis
Lọc bụi Syring0, 2µm Đèn led Dụng cụ điều chỉnh khí
24
Quá trình gây stress được thực hiện ở trạng thái tĩnh trong erlen 250 ml và 50 ml với thời gian chiếu sáng khác nhau tùy thuộc vào các nghiệm thức.
Điều kiện ni cấy
H. pluvialis là lồi vi tảo khá nhạy cảm với những thay đổi của môi trường
nên trong q trình ni cấy những thơng số sau cần được kiểm soát chặt chẽ (bảng 2.2)
Bảng 2.2: Một số thông số ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của H.pluvialis
Nhiệt độ 25 oC
Cường độ ánh sáng 2 Klux
Thời gian chiếu sáng 12 giờ sáng : 12 giờ tối Tốc độ khí Đảo đều tảo
Hàm lượng các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng của H.pluvialis thấp và sẽ
có hiện tượng kết tủa nếu áp dụng cách pha thơng thường vì vậy cần pha mơi trường ở
dạng stock để đem lại hiệu quả tốt nhất cho các thí nghiệm. Thể tích giống ban đầu được bổ sung một lượng từ 10 % đến 20 % thể tích cần có.
2.2.2 Xác định đường cong sinh khối khô
Nguyên tắc
Ở những môi trường khác nhau tế bào sinh trưởng ở một tốc độ khác nhau nên lượng sinh khối thu được sẽ khác nhau.
Cách tiến hành
- Dựng đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD610 nm và trọng lượng sinh khối khô của tế bào (mgml)
Pha lỗng dịch ni vi tảo trong môi trường BG11, RM, F2 sao cho độ đục
ở OD610 nmđạt giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5.
Tiến hành ly tâm ở 4500 vòng/phút trong 5 phút thu sinh khối vi tảo của
từng môi trường ở các giá trị OD nói trên, mỗi nghiệm thức thực hiện 3 lần để lấy giá trị trung bình.
25
Sau đó sấy khơ lượng sinh khối thu được trong 105oC trong 2 giờ và cân đến khi trọng lượng không đổi. Thực hiện 3 lần sấy và cân sinh khối sau sấy.
Tính trọng lượng sinh khối khô trên 1ml môi trường (mg/ml).
Dựng đường tương quan tuyến tính giữa các giá trị OD610và trọng lượng tế bào khô (mg/ml).
- Xác định đường cong sinh khối khô
Nuôi vi tảo ở điều kiện tối ưu và đo OD sau mỗi 24 giờ đến khi giá trị OD giảm thì dừng. Từ giá trị OD suy ra trọng lượng sinh khối khô dựa vào đường tương quan tuyến tính. Vẽ đồ thị đường cong sinh khối khô.
2.2.3 Xác định đường cong tăng trưởng
Nguyên tắc
Sự sinh trưởng của vi sinh vật trải qua các pha là tiềm tàng, lũy thừa, ổn định và suy tàn. Mật độ tế bào ở những pha khác nhau thì khác nhau, điều này được thể
hiện qua độ hấp thu ánh sáng khi được đo ở cùng một bước sóng.
Cách tiến hành
- Dựng đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD610 nm và mật độ tế bào log (N/ml)
Pha lỗng dịch ni vi tảo trong môi trường được xác định là tối ưu sao cho
độ đục ở OD610đạt giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5.
Tiến hành đếm trực tiếp tế bào vi tảo bằng buồng đếm hồng cầu ở các nồng
độ có các giá trị OD kể trên, thực hiện đếm 2 lần để lấy giá trị trung bình.
Tính số lượng tế bào trên 1ml môi trường (N/ml).
Dựng đường tương quan tuyến tính giữa các giá trị OD610và mật độ tế bào log (N/ml) [46].
- Xác định đường cong tăng trưởng
Nuôi vi tảo ở các điều kiện tối ưu và đo OD610 sau mỗi 24 giờ đến khi thấy OD giảm thì dừng. Từ giá trị OD suy ra mật độ tế bào dựa vào đường tương quan tuyến tính.
26
Vẽ đồ thị đường cong tăng trưởng log (N/ml).
2.2.4 Xác định thời điểm dừng quá trình gây stress
Nguyên tắc
Tế bào vi tảo chuyển sang giai đoạn bào nang khi gặp điều kiện bất lợi, lúc này quá trình tích lũy astaxanthin bắt đầu diễn ra trong nhân tế bào, khi trở thành bào
nang trưởng thành thì tế bào có màu đỏ [29].
Cách tiến hành
Sử dụng kính hiển vi để theo dõi sự thay đổi kích thước, hình thái và màu sắc trong tế bào H.pluvialis từ khi bắt đầuquá trình gây stress.
Quá trình này sẽ dừng lại khi tế bào phát triển thành bào nang trưởng thành.
2.3 Nội dung 3. Nghiên cứu quy trình tách chiết astaxanthin từ Rhodosporidium sp. và vi tảo Haematococcus pluvialis và vi tảo Haematococcus pluvialis
2.3.1 Quy trình tách chiết astaxanthin từ nấm men sử dụng dung môi hữu cơ
Rửa sạch tế bào nấm men trong đệm PBS Ly tâm, thu sinh khối sạch
Xử lý sinh khối với HCl ở nồng độ thích hợp trong 45 phút Bổ sung dung mơi tách chiết
Lắc hỗn hợp chiết liên tục ở tốc độ 200 vòng/phút trong 1 giờ, ở 30oC Ly tâm thu dịch nổi có chứa astaxanthin
Đuổi dung mơi, sấy khô chân không và thu nhận chế phẩm astaxanthin
2.3.2 Phương pháp tách chiết astaxanthin từ Haematococcus pluvialis
Nguyên tắc
Thành tế bào H. pluvialis khá vững chắc với 70 % là carbohydrate, 3%
cellulose mà astaxanthin được tích lũy bên trong tế bào. Mà DMSO là dung mơi có khả năng phá thành tế bào nên sẽ giúp q trình chiết có hiệu quả tốt hơn.
Cách tiến hành
- Loại bỏ chlorophyll
Các tế bào nang H.pluvialisđược xử lí với 5%KOH trong 30% methanol
27
°C, phần tủa được rửa sạchvới 2 ml nước cất và bổ sung vài giọt acid acetic để đưa pH về trung tính [45].
- Tách chiết astxanthin bằng DMSO và acetone
Phần sinh khối khôsau khi loại chlorophyll sẽ ủ trong 10ml DMSO ở 55oC. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi chứa DMSO. Thực hiện phá thành tế bào 2 lần với DMSO.
Thêm vào phần tủa 5ml acetone, vortex kĩ sau đó ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi (chiết 2-3 lần đến khi phần cặn hết sắc tố).
Gom chung tất cả dịch chiết DMSO và acetone vào bình lắng. Thêm petrolium ether (tỉ lệ petrolium ether:dịch chiết là 1:2) và 10ml nước cất, thêm 5ml NaCl bão hòa nếu sắc tố khơng tách pha. Thu pha petrolium ether có chứa sắc tố ở phía trên.
Thêm nước vào dịch chiết sắc tố (tỉ lệ 1:1) bỏ pha nước (chứa acetone,
DMSO), thu dịch chiết sắc tố trong pha petrolium ether phía trên. Lặp lại bước này 3-5 lần để loại hoàn toàn DMSO và acetone.
Thêm Na2SO4 khan để loại nước, thu dịch nổi sắc tố trong pha petrolium ether. Thêm petrolium ether để tất cả đạt một thể tích nhất định.
Đo độ hấp thu của dịch chiết ở bước sóng 468nm [8].
2.3.3 So sánh phương pháp tách chiết bằng bột thủy tinh và DMSO
- Tách chiết bằng bột thủy tinh
Nghiền 0,005g sinh khối tảo khô đã được loại chlorophyll trong 0,01g bột thủy tinh, sau đó chiết 2 lần với acetone, ly tâm thu dịch ở 5000 vòng/phút trong 10 phút [70].
Gom chung tất cả dịch chiết acetone vào bình lóng. Thêm petrolium ether (tỉ lệ petrolium ether:dịch chiết là 1:2) và 10ml nước cất, thêm 5ml NaCl bão hòa nếu sắc tố khơng tách pha. Thu pha petrolium ether có chứa sắc tố ở phía trên.
Thêm nước vào dịch chiết sắc tố (tỉ lệ 1:1) bỏ pha nước (chứa acetone, DMSO),
thu dịch chiết sắc tố trong pha petrolium ether phía trên. Lặp lại bước này 3-5 lần để loại hoàn toàn acetone.
28
Thêm Na2SO4 khan để loại nước, thu dịch nổi sắc tố trong pha petrolium ether.
Thêm petrolium ether để tất cả đạt một thể tích nhất định. - Tách chiết bằng DMSO
0,005 g sinh khối khô sau khi được loại cholorophyll sẽ được tách chiết theo quy trình như đã trình bày ở mục trên.
Đo độ hấp thu của các dịch chiết ở bước sóng 468 nm [8].
2.3.4 Phương pháp đánh giá hàm lượng astaxanthin của Rhodosporidium sp và vi
tảo Haematococcus pluvialis
2.3.4.1 Định tính astaxanthin bằng phương pháp sắc kí bản mỏng (TLC)
Sắc tố sau khi được tách chiết thì tiến hành chạy sắc kí lớp mỏng để xác định sự có mặt của astaxanthin trong dịch chiết, cách tiến hành như sau:
- Bản sắc kí sau khi được kẻ 2 đường viết chì cách đáy và đỉnh 1cm thì chấm sắc tố lên 1 đường kẻ, điểm chấm phải đậm, để khô tự nhiên, yêu cầu chiều dài bản sắc kí là 10cm.
- Cho hệ dung mơi acetone:hexan tỉ lệ 1:4 vào bồn sắc kí, cho bản sắc kí vào khi hệ dung mơi đã bão hịa.
- Lấy giấy sắc kí ra khỏi bồn khi dung môi chạy tới điểm cách đỉnh 1cm,
đánh dấu mực dung môi.
- Sau khi giấy khơ hồn tồn, đo khoảng cách di chuyển của số tố, tính Rf của sắc tố.
Rf = (CT 2.1)
Kết quả chạy sắc kí của mẫu sắc tố tách chiết được so sánh với mẫu astaxanthin
thương mại được sản xuất bởi công ty DSM Nutritional Products Vietnam Ltd. [6]
2.3.4.2 Định tính astaxanthin bằng phương pháp quét bước sóng
Sắc tố sau khi được tách chiết thì tiến hành qt bước sóng từ 300 nm – 600 nm để
xác định sự có mặt của astaxanthin trong dịch chiết. Sau đó so sánh với bước sóng hấp
29
2.3.4.3 Định lượng astaxanthin theo công thức Kelly-Harmon (1972)
Dựa vào độ hấp thụ ở bước sóng 468 nm của dịch chiết thu được có thể tính được
hàm lượng astaxanthin theo cơng thức sau:
X = (CT 2.2) [8,27]
trong đó; X: hàm lượng astaxanthin (µg/g).
A468: Độ hấp thu của dịch chiết sắc tố trong dung môi ether dầu hỏa ở 468 nm.
V: thể tích dịch chiết sắc tố (ml)
E 1cm: độ hấp thu dung dịch astaxanthin 1% trong dung môi PE (với
cuvette 1cm).
G: trọng lượng sinh khối nấm men/tảo (g).
- Hàm lượng Astaxanthin được xác định bằng phương pháp của Kelly-Harmon (1972) hoặc phương pháp HPLC.
2.4 Nội dung 4. Nghiên cứu quy trình tách chiết b-glucan từ sinh khối nấm men
Rhodospridium sp. và từ bã men bia (Saccharomyces cerevisiae)
· Rửa sạch tế bào tảo và nấm men trong đệm PBS · Ly tâm, thu sinh khối sạch
· Xử lý sinh khối với NaOH ở nhiệt độ cao trong 1 giờ · Sau 1 giờ, thêm nước lạnh để ngừng phản ứng
· Ly tâm thu vách tế bào nấm và bảo quản ở 4oC
· Rửa vách tế bào nấm nhiều lần bằng kiềm ấm để loại tạp chất · Ly tâm thu b-glucan
· Sấy khô, thu nhận chế phẩm b-glucan
· Bộ kít định lượng β-glucan trong nấm (K-YBGL 04/2008) [34]
2.5 Nội dung 5. Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung astaxanthin vào thức ăn với việc tăng cường màu sắc ở cá dĩa đỏ Symphysodon sp. (so sánh với sản phẩm việc tăng cường màu sắc ở cá dĩa đỏ Symphysodon sp. (so sánh với sản phẩm
30
2.5.1 Mục tiêu
Thí nghiệm nhằm đánh giá hiệu quả của astaxanthin chiết xuất và xác định được liều lượng thích hợp để bổ sung Astaxanthin vào thức ăn cho cá dĩa đỏ Symphysodon sp.
2.5.2 Vật liệu thí nghiệm
+ Đối tượng thí nghiệm : Cá dĩa đỏ Symphysodon sp. thí nghiệm được ni dưỡng trong
bể sau đó chọn những cá cùng kích thước để bố trí thí nghiệm, cá có kích thước 6 cm (cá 3
tháng tuổi), khỏe mạnh và không dị tật.
+ Bể kính kích thước 1,2 m x 0,6 m x 0,6 m.
+ Thức ăn chính cho cá dĩa đỏ: Thức ăn chế biến (tim bò 97,9%;2,1% vitamin tổng hợp). + Các test kiểm tra chất lượng nước như pH, oxy, độ cứng.
2.5.3 Phương pháp thực hiện
Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp hồn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, gồm 3
nghiệm thức, mỗi nghiệm thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần lặp lại bố trí 1 bể kiếng có 30 con cá dĩa đỏ. Q trình thí nghiệm được tiến hành với các thông số điều kiện chất lượng nước thích hợp, pH = 6,5, nhiệt độ 28 – 300C, độ cứng nước 8 – 10 0
dH.
Bảng 2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Nghiệm thức Nội dung
A-CX Thức ăn được bổ sung astaxanthin chiết xuất (sản phẩm của đề tài) với lượng 90 mg/kg thức ăn
A-TT Thức ăn được bổ sung astaxanthin bán trên thị trường với lượng 90 mg/kg thức ăn
ĐC Thức ăn không được bổ sung astaxanthin
Hàm lượng astaxanthin được bổ sung vào thức ăn như sau: Tim bò được xây
nhuyễn, bổ sung thêm các sắc tố bằng cách hoà tan sắc tố trong nước ấm (600 C) sau đó
trộn đều hỗn hợp cho tới khi hỗn hợp có màu đỏ cam, ép tim bò thành miếng mỏng, trữ ở nhiệt độ từ - 5 – 00C cho cá ăn dần.
Trong thời gian thí nghiệm cá được cho ăn 2 lần /ngày với thức ăn có trộn astanxanthin.
Lượng thức ăn được kiểm tra và điều chỉnh theo nhu cầu. Thức ăn với nghiệm thức đối chứng bao
gồm (tim bị + vitamin tổng hợp). Thời gian thí nghiệm là 90 ngày.Trước khi bắt đầu thí nghiệm, thu mẫu 30 cá/ nghiệm thức để đánh giá chỉ số màu sắc. Trong thời gian thí nghiệm cá được đánh
31
giá chỉ số màu sắc 2 tuần / lần. Kết thúc thí nghiệm, so sánh các kết quả thu được từ các nghiệm thức để xác định liều bổ sung hiệu quả nhất của astaxanthin vào thức ăn cho cá dĩa.
2.5.4 Chỉ tiêu theo dõi
+ Chỉ số màu sắc: 2 tuần / lần, được đánh giá lần đầu tiên trước khi ni và sau đó là 2 tuần/lần bằng quạt so màu sắc cho cơ thịt cá hồi (SalmoFanTM).
Hình 2.4 Quạt màu dùng so sánh màu sắc cho cơ thịt cá hồi (Diler và ctv, 2002)
+ Các chỉ tiêu chất lượng nước: Hàm lượng oxy hòa tan (mg/L), pH, nhiệt độ nước, hàm
lượng amonia (mg/L), NO2.
Kết quả dự kiến đạt được là liều lượng, bổ sung hiệu quả nhất của astaxanthin vào thức ăn cho
cá dĩa đỏ.
2.6 Nội dung 6. Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung b-glucan vào thức ăn với việc tăng cường sức đề kháng ở cá dĩa đỏ tăng cường sức đề kháng ở cá dĩa đỏ
2.6.1 Mục tiêu
Thí nghiệm nhằm đánh giá hiệu quả của β-glucan và xác định được liều lượng thích hợp để
bổ sung β-glucan vào thức ăn cho cá dĩa đỏ.
2.6.2. Vật liệu thí nghiệm
+ Đối tượng thí nghiệm : Cá dĩa đỏ thí nghiệm được ni dưỡng trong bể sau đó chọn