H ầu hết các th àn h phần cấu trúc của tế bào thấu quang đôi vối ánh sáng thấy được trừ một sô" sắc tơ" (có mặt trong tế bào thực vật) hấp thụ các tia có độ dài sóng nhất định (các chất có màu). Sự hấp thụ yếu ánh sáng của các thành phần trong tế bào là do hàm lượng nước trong đó chi phơi. Tuy nhiên dù có làm m ất nước đi thì các th àn h phần của tê bào cũng không tạo đủ độ tương phản.
Người ta khắc phục giới hạn đó bằng cách sử dụng chọn lọc các phẩm nhuộm mà, do đó nâng cao được khả năng hấp thụ ánh sáng và tăng được độ tương phản của ảnh. Tuy vậy, nhuộm màu các bộ phận tức là làm cho tế bào chết. Sự chết của tế bào cùng với việc có nhiều thao tác xử lí làm cho tế bào bị biến đổi về hình dạng, về hố học.
Cho nên người ta phải dùng phương pháp quang học đặc biệt, n h ấ t là kĩ thuật hiến vi đối pha và giao thoa để việc
nghiên cứu tê bào sông thuận lợi hơn. Cả hai phương pháp vừa nói trên dựa trên nguyên tắc là các cấu trúc sinh học mặc dầu trong suốt trong ánh sáng nhìn thấy được đều có khả năng làm biến đổi pha của các tia sáng đi qua tê bào. Các biến đôi này
khác nhau ở các phần khác nhau, có chỉ sơ" khúc xạ và độ dày khác nhau. Với kính hiển vi đối pha và giao thoa, người ta có thể quan sát được sự khác nhau của các tê bào. Lúc ánh sáng đi qua một vật trong suốt, chỉ sô" khúc xạ của nó khác biệt vối chỉ scí khúc xạ của mơi trường xung quanh. Trong trường hợp này, biên độ dao động của sóng vẫn giữ nguyên không đổi mà chỉ tốc độ truyền sóng bị thay đổi. Nếu chỉ sô" khúc xạ của vật cao hơn độ khúc xạ của môi trường thì xảy ra sự giữ ánh sáng chậm lại - gọi là sự biến đổi hoặc lệch pha. Trong ánh sáng đã đi qua vật, tốíc độ truyền ban đầu được khôi phục, nhưng sự chậm của pha thì vẫn giữ lại và ta có thể đo được sự chậm đó bằng độ dài sóng. Sự biến đổi pha tăng tỉ lệ th u ậ n với hiệu số của độ khúc xạ của vật quan sát và môi trường xung quanh và với độ dày của vật quan sát.
Để làm rõ thêm nguyên tắc cấu tạo hiến vi đối pha, chúng ta xét đường đi của chùm ánh sáng thấy được qua một vật mỏng trong suốt có chỉ sơ' khúc xạ gần vối chỉ số khúc xạ của môi trường xung quanh. Vật mỏng như vậy là cản trở tán xạ đôi với các tia sáng. Một phần của chùm sáng lúc đi qua vật mỏng không bị lệch và vẫn giữ nguyên biên độ và độ dài sóng.
Vối các nguyên liệu sinh học, hiệu các pha giữa sóng s và sóng D trong miền nhìn thấy được của quang phổ xấp xỉ bằng
_ X. Trong vật kính của kính hiển vi, hai sóng đó giao thoa với
4
nhau. Sóng được hình th àn h có độ dài sóng và biên độ giao động như sóng đã đi qua mơi trường, nhưng khác ít nhiều với nó về pha. Sự khác biệt đó chưa đủ để có thể nhìn thây vật mỏng dưối hiển vi thường.
Trong hiển vi đôi pha do Xenicke thiết kế, để chỉnh các phương của kính viễn vọng, sự khác biệt nhỏ của các pha của ánh sáng trực xạ và tán xạ được chuyển th àn h sự sai khác vể
biên độ khiến cho chúng ta có thể quan sát bằng mắt được vật hay ảnh chụp của nó. Mn thê tia sáng đã bị lệch do tán xạ lại đươc dich thêm 1/4 đô dài sóng ( — X) về cả hai phía nhờ các
4
bản pha hình vịng đặt ở m ặt phẳng tiêu cự sau vật kính. Nhờ bản mỏng đó, các tia sáng trực xạ và các tia đã bị lệch hoặc bắt đầu trùng nhau về pha, hoặc giữa chúng phát sinh sự khác biệt về pha bằng — X. Ngoài ra, để giảm cường đô của chùm sáng
4
tru n g tâm, người ta còn gắn vào tụ quang của kính hiển vi một màn sáng chắn dạng vòng, kết quả là các sóng D và s trở nên so sánh được theo biên độ.
Bản pha là một bản mỏng trong suốt có gắn vối một gờ nổi hình vịng có dạng và kích thưốc trùng vối màn chắn hình vịng của tụ quang. Hiệu ứng pha được tạo ra nhờ kết quả của sự giao thoa của các tia trung tâm không bị lệch lúc đi qua vật và các tia bên đã bị khúc xạ. Các tia đó nhờ đi qua cả vật và qua bản pha nên hoặc trùng về pha với các tia trung tâm hoặc bị lêch so vối các tia này - Ịầ. Trong trường hơp đầu, hai sóng đè
2
lên nhau và hình ảnh của vật trở nên sáng hơn so với nền xung quanh. Trong trường hợp thứ hai, sóng D tách khỏi sóng s, và vật sẽ được nhìn thấy thẫm hơn nền xung quanh.
Hiện nay, kính hiển vi đôi pha là phương tiện được dùng rộng rãi trong việc quan sát các tế bào mơ sơng. Nó cho phép quan sát được các chi tiết rấ t nhỏ của cấu trúc tê bào, những tiêu bản của tê bào được nuôi trong dung dịch sinh lí. Nếu sử dụng quay phim hiển vi thì có thể theo dõi các biến đổi xảy ra trong tê bào, ti thể, lục lạp ...