Độ cứng của quả cà chua biểu thị cho độ chín của chúng. Độ cứng được đo bằng máy đo độ cứng, dựa trên nguyên tắc đo độ lún dưới tác động của một lực bằng nhau theo phương vuông góc với mặt phẳng của quả trong cùng một đơn vị thời gian. Quả càng mềm thì độ lún càng lớn.
2.2.1 .2. Xác định hàm lượng chất khô hoà tan
Hàm lượng chất khô hòa tan được xác định bằng chiết quang kế dựa trên nguyên tắc tia sáng bị khúc xạ khi đi từ một môi trường (không khí) vào một trường khác (chất lỏng). Dựa vào độ lệch của tia sáng có thể xác định được hàm lượng chất hòa tan trong chất lỏng.
2.2.1.3. Xác định hàm lượng lycopen: theo phương pháp AOAC-941.15 [60]
Nguyên lý: Lycopen trong mẫu thực phẩm hoặc huyết thanh được chiết theo phương pháp AOAC-941.15 bằng dung môi hữu cơ thích hợp sau đó được đem phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) với detector PDA
Chất chuẩn: Lycopen (Sigma-Mỹ)
Cột sắc ký: cột Symmetry C18 (150mm x 4,6mm x 5µm)
Pha động: Hỗn hợp Acetonitril : Methanol : Dichlomethane (70:20 ) :10 Tốc độ dòng: 1ml/phút
Nhiệt độ cột: 300C Detector UV 476nm
Lycopen được xác định bằng cách so sánh thời gian lưu với chất chuẩn, đồng thời dựa vào phổ tử ngoại 3 chiều của các chất trên detector PDA.
2.2.1.4. Xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật[75]
Nguyên tắc: Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật được chiết ra khỏi mẫu bằng dung môi acetone và được xác định bằng phương pháp sắc ký khí với detector cộng kết điện tử (ECD). Các chất thuộc nhóm hóa chất bảo vệ thực vật được xác định là nhóm pyrethroids điển hình là cyperthrin, nhóm phospho hữu cơ và clo hữu cơ.
Điều kiện phân tích chương trình sắc ký GC-ECD:
Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 240oC
Chương trình nhiệt độ: nhiệt độ đầu 80oC trong 1 phút, tốc độ tăng nhiệt 40oC/phút đến nhiệt độ 160oC, tăng 3oC /phút đến 250oC, tăng 10oC/phút đến nhiệt độ cuối 280oC giữ trong 20 phút.
Nhiệt độ detector: 300oC
Tốc độ khí mang (N2): 2 ml/ phút Tốc độ khí nitơ bổ trợ: 60 ml/phút
Thể tích bơm mẫu: 1 µl, không chia dòng
2.2.2. Phương pháp hóa sinh
2.2.2.1. Định lượng cholesterol toàn phần [117]
Được định lượng bằng phương pháp so màu theonguyên tắc: cholesterol este trong huyết thanh được thủy phân bởi enzym cholesterol esterase (CHE). Cholesterol tự do tạo thành bị oxy hóa thành cholestene-3-one và hydro peroxyd (H2O2) dưới xúc tác của enzym cholesterol oxidase (CHO). H2O2 liên kết oxy hóa (oxidatively couples) với 4 aminoantipyrin và phenol với sự hiện diện của enzym - peroxidase (POD) tạo thành quinoneimine có màu đỏ. Nồng độ cholesterol có trong bệnh phẩm tỷ lệ với sự tăng độ hấp thụ của quinoneimin ở bước sóng 540nm. Nồng độ cholesterol toàn phần được tính theo đơn vị mmol/l.
2.2.2.2. Định lượng triglycerid [117]
Được định lượng bằng phương pháp so màu theo nguyên tắc: Triglycerid trong huyết thanh bị thủy phân bởi enzym lipase vi khuẩn, tạo thành glycerol và acid béo. Với sự có mặt của ATP và enzym glycerolkinase, glycerol bị phosphoryl hóa thành glycerol-3-phosphat. Glycerol-3-phosphat sau đó bị oxy hóa thành H2O2 và dihydroxyaceton phosphat dước tác dụng của glycerolphosphat oxydase. H2O2
được sử dụng trong phản ứng liên kết giữa 4-clorophenol và 4-aminoantipyrin với sự xúc tác của enzym peroxidase tạo thành quinoeimin có màu đỏ. Nồng độ triglycerid có trong huyết thanh tỷ lệ với sự tăng độ hấp thụ của quinoneimin ở bước sóng 520nm. Nồng độ triglycerid được tính theo đơn vị mmol/l.
2.2.2.3. Định lượng HDL-C huyết thanh[117]
Bằng phương pháp so màu theo nguyên tắc: Kháng thể kháng β-lipoprotein của người trong thuốc thử R1 gắn với các lipoprotein không phải HDL-C (LDL C, - VLDL, chylomicron). Phức hợp miễn dịch tạo thành sẽ cản trở các phản ứng enzym của các lipoprotein này khi thuốc thử R2 được thêm vào HDL, và LDL-C được định lượng bởi sự có mặt của một hệ thống enzym tạo màu. Nồng độ HDL-C có trong bệnh phẩm tỷ lệ với sự tăng độ hấp thụ của blue dye ở bước sóng 600nm, được tính theo đơn vị mmol/l.
2.2.2.4. Xác định hoạt tính chống oxy hóa khả năng quét gốc tự do DPPH [111] –
Nguyên tắc: Dựa trên sự khử DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) bởi một chất có khả năng nhường nguyên tử hydro. Khi dung dịch DPPH được trộn với dung dịch của chất có khả năng nhường nguyên tử hydro thì độ hấp thụ của hỗn hợp giảm. Nguyên nhân là do sự thay đổi màu sắc từ màu tía sang màu vàng nhạt khi gốc tự do bị “thu gom” bởi các chất chống oxy hóa thông qua việc nhường nguyên tử hydro để tạo thành DPPH-H bền. Xác định độ hấp thụ của hỗn hợp để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thí nghiệm. Độ hấp thụ giảm càng mạnh thì hoạt tính chống oxy hóa của mẫu càng lớn.
Tiến hành xác định hoạt tính chống oxy hóa (% quét gốc tự do DPPH) của dịch có hàm lượng bột cà chua 100, 500, 1000µg/ml sau 30 phút phản ứng bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 517nm.
2.2.3. Phương pháp vi sinh
2.2.3.1. Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí:Theo TCVN 4884:2005 ][40
Nguyên tắc: sử dụng kỹ thuật đổ đĩa, đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch, sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 30 ± 10C trong thời gian từ 48- 72h. Số lượng hiếu khí trong 1 g (hoặc 1 ml) mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm được tính theo số khuẩn lạc đếm được từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng.
2.2.3 .2. Xác định tổng số coliforms:Theo TCVN 4882:2007 [43]
Nguyên tắc: Phát hiện và định lượng coliforms bằng kỹ thuật nuôi cấy trong môi trường lỏng ủ ở 370C, sử dụng cách tính số có xác xuất lớn nhất (MPN) để tính kết quả. Tổng số Coliform được xác định bằng số ống dương tính sau khi nuôi cấy vào các ống canh thang brilliantgreen broth 2% ở 370C/24- 48giờ.
2.2.3.3. Xác định tổng số E. coli: Theo TCVN 6846:2007 [44]
Nguyên tắc: Phát hiện và định lượng E. coli bằng kỹ thuật nuôi cấy trong môi trường lỏng ủ ở 370C, rồi ủ ở 440C, sử dụng cách tính số có xác xuất lớn nhất (MPN) để tính kết quả. Tổng số E.coli được xác định bằng các tính chất sinh hoá từ những ống dương tính nói trên sau khi làm thử nghiệm IMViC++--.(Indol+, Methyl Dred+, Voges-Proslcauer-Citrate)
2.2.3.4. Xác định B. cereus:Theo TCVN 4992:2005 [42]
Nguyên tắc: Cấy một lượng mẫu thử qui định nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc một lượng huyền phù ban đầu qui định nếu các sản phẩm ở dạng khác, lên bề mặt môi trường cấy đặc chọn lọc đựng trong đĩa petri. Ủ trong điều kiện hiếu khí ở 300C từ 18 48 giờ. Tính số lượng – B.cereustrong 1 mlhoặc trong 1gam mẫu từ số lượng khuẩn lạc khẳng định thu được trên các đĩa ở các độ pha loãng đã chọn sao cho kết quả có ý nghĩa và được khẳng định theo phép thử qui định.
2.2 .5.3 . Xác định Cl. perfringens: Theo TCVN 4991:2005 [ ] 41
Nguyên tắc: Các đĩa petri được cấy một lượng mẫu thử qui định, nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc một lượng huyền phù ban đầu qui định nếu các sản phẩm ở dạng khác. Ủ trong điều kiện kỵ khí các đĩa ở 370C trong 20 giờ. Định lượng các khuẩn lạc điển hình.
2.2.3.6. Xác định tổng số bào tử nấm men, nấm mốc: Theo TCVN 5166:90 39 [ ] Nguyên tắc: Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa đếm khóm nấm trên môi trường thạch, sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 28±10 C trong thời gian từ 5 7 ngày. Số lượng bào tử nấm - men, nấm mốc trong 1g (ml) mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm được tính theo số khóm nấm đếm được từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng.
2.2.4. Phương pháp đánh giá cảm quan
Sử dụng phép thử cho điểm chất lượng tổng hợp của sản phẩm, thực hiện theo tiêu chuẩn TCVN 3215-79 [ ]50 . Chất lượng sản phẩm được đánh giá trên hệ điểm 20 xây dựng trên một thang thống nhất 6 bậc, 5 điểm (từ 0 đến 5), trong đó điểm 0 tương ứng với chât lượng sản phẩm bị hỏng, còn điểm từ 1 đến 5 tương ứng với mức khuyết tật giảm dần. Tổng hệ số trọng lượng của tất cả các chỉ tiêu được đánh giá cho một sản phẩm bằng 4.
Quá trình đánh giá cảm quan được thực hiện trong phòng phân tích cảm quan. Hội đồng đánh giá cảm quan gồm 10 chuyên gia có hiểu biết về sản phẩm được đánh giá. Các thành viên cho điểm vào phiếu và nộp lại sau giờ làm việc. (Mẫu phiếu và bảng cho điểm đánh giá cảm quan được trình bày trong phụ lục 7)
Bảng 2.1. Tiêu chuẩn chất lượng đánh giá cảm quan theo TCVN 3215-79 Số TT Mức chất lượng Điểm Số TT Mức chất lượng Điểm 1 Tốt 18,6 20- 2 Khá 15,2 18,5- 3 Trung bình 11,2 - 15,1 4 Kém 7,2 11,1- 5 Rất kém 4,0 ,1- 7 6 Hỏng 0,0 3,9-
Điểm chất lượng của sản phẩm được tính toán dựa trên điểm của các thành viên và hệ số trọng lượng của các chỉ tiêu cảm quan. Theo hệ điểm 20, chất lượng cảm quan của sản phẩm được chia thành 6 mức (bảng 2.1).
2.2.5. Phương pháp toán học
2.2.5.1. Qui hoạch thực nghiệm[52]
Phương pháp quy hoạch thực nghiệm cho phép nghiên cứu đồng thời tác động của nhiều yếu tố lên quá trình mà chúng ta cần quan tâm, cũng như những tác động qua lại của các yếu tố này. Ngoài ra, phương pháp còn cho phép đánh giá một cách định lượng v mề ức độ ảnh hưởng của chúng. Phương pháp này cho phép sử ụ d ng số thí nghiệm chọn lọc ít nhất mà có thể diễn tả được nhiều nhất ảnh hưởng của các yếu tố đã chọn.
Các bước ti n hành: ế
+ Lựa chọn các thông số ảnh hưởng và khoảng biến thiên của các thông số đã lựa chọn.
+ Xây dựng ma trận thực nghiệm và tiến hành thí nghiệm.
Kếhoạch bậc hai tâm xoayđã được sử ụ d ng với nhân kế hoạch 2k. Số ầ l n thí nghiệm được xác định theo công thức 2.1.
N=2k + 2k + n0 (2.1) N: Số thí nghiệm
k: Số yếu tố ảnh hưởng đến hàm mục tiêu 2k: Số thực nghiệm ở cánh tay đòn sao α n0: Số thí nghiệm tại tâm
+ Tính toán hệ số hồi quy
+ Kiểm định sự có nghĩa của hệ số hồi quy + Kiểm định sự tương thích của mô hình + Tối ưu hóa chập mục tiêu
Phương pháp tối ưu hóa đa mục tiêu- Phương pháp hàm mong đợi
Đây là phương pháp đơn giản cho phép phối hợp nhiều mục tiêu trong một phép đo định lượng. Phương pháp này gồm 3 bước tiến hành:
- Thiết lập các hàm mục tiêu: Yi = fi (x1, x2, …., xk)
- Chuyển đổi các hàm mục tiêu thành hàm d: di = Ti ( Yi, mục tiêu) - Thiếp lập hàm mong đợi D: D = g (d1, d2, …., dm)
Hàm mong đợi D được tính như sau:
D = (2.2)
Trong trường hợp các hàm mục tiêu di có tầm quan trọng (hay thứ bậc) khác nhau, thì hàm D được tính như sau, có tính đến thứ bậc quan trọng (wi) của các mục tiêu:
D=w d d1w1. 2w2...dmwm
(2.3)
Trong đó: w = (2.4)
Các hàm diđược tính theo công thức do Derringer và Suich (1980) như sau: Khoảng chấp nhận 1 phía, bên phải (cực đại hóa):
di= 0 nếu Yi < Ymin(giá trị min chấp nhận)
i wt ax d min Y - Y i m i d Y Y−
= nếu Ymin ≤ Yi≤Yd (2.5)
di= 1 nếu Yi>Yd(giá trị đích) Khoảng chấp nhận 1 phía, bên trái (cực tiểu hóa):
di= 1 nếu Yi < Yd(giá trị đích) i wt max max i i d Y Y d Y Y − = − nếu Yd ≤ Yi ≤ Ymax (2.6)
Khoảng chấp nhận 2 phía:
di= 0 nếu Yi≤Ymin
i wt1 ax d min Y - Yi m i d Y Y−
= nếu Ymin<Yi<Yd (2.7)
di = 1 nếu Yi=Yd i wt2 max max i i d Y Y d Y Y − =
− Nếu Yd<Yi<Ymax (2.8)
di= 0 nếu Yi≥Ymax 2.2.5.2. Phân tích số liệu
Sử dụng các test thống kê tham số: t test cho kiểm định sự khác nhau giữa - 2 giá trị trung bình, ANOVA - test cho kiểm định sự khác nhau giữa nhiều giá trị trung bình. Khoảng tin cậy 95% được áp dụng cho toàn bộ các test. Nhận định có sự khác biệt khi giá trị p<0,05.
2.3. PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM LÂM SÀNG 2.3.1. Đối tượng nghiên cứu 2.3.1. Đối tượng nghiên cứu
2. .1.1.3 Đối tượng nghiên cứu cắt ngang
Gồm những sĩ quan nam và nữ đang công tác tại một số đơn vị Bộ Tư lệnh Bộ đội Biên phòng, tuổi từ 30 – 59.
2. .1.2.3 Đối tượng nghiên cứu thử nghiệm
+ Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng: Là những sĩ quan bị thừa cân béo phì, có rối loạn lipid máu thỏa mãn các điều kiện sau:
Tuổi từ 30 – 59 BMI ≥ 23
+ Có rối loạn lipid máu: các đối tượng có 1 hoặc 2 chỉ tiêu lipid máu cao theo phân loại của WHO 2000 [160]:
Cholesterol huyết thanh tổng số > 5,2 mmol/l (200mg/d l); Hoặc Triglycerid huyết thanh >2,26 mmol/l (200mg/dl) Hoặc HDL C huyết thanh < 0,9 mmol/– l (35mg/dl) Hoặc LDL C huyết thanh > 3,38 mmol/– l (130mg/dl)
Huyết áp tâm thu < 160 mmHg, huyết áp tâm trương < 100 mmHg.
Hiện và trong vòng 3 tháng qua không tham gia bất kỳ chế độ ăn kiêng hoặc chương trình giảm cân hoặc giảm rối loạn lipid máu. Tự nguyện không dùng thuốc hạ mỡ máu trong 3 tháng nghiên cứu.
Được sự đồng ý của chỉ huy đơn vị. Có sự tham gia tự nguyện của đối tượng. Phiếu tự nguyện tham gia nghiên cứu được các đối tượng nghiên cứu cam kết trước khi triển khai thử nghiệm.
+ Tiêu chuẩn loại trừ:
Có dị tật bẩm sinh, hoặc có tiền sử mắc các bệnh m n tính (lao, bệnh gan, đái ã tháo đường, tim mạch, suy thận).
Phụ nữ có thai, phụ nữ cho con bú. 2.3.2. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu này được thiết kế bao gồm 2 nghiên cứu liên tiếp tương ứng với 2 giai đoạn là nghiên cứu mô tả và thử nghiệm lâm sàng có đối chứng trên cộng đồng. Giai đoạn 1: điều tra cắt ngang mô tả thực trạng thừa cân béo phì và rối loạn lipid – máu để sàng lọc đối tượng có thừa cân béo phì, rối loạn lipid máu trước khi thử – nghiệm.
Giai đoạn 2: sử dụng phương pháp thử nghiệm lâm sàng có đối chứng để đánh giá hiệu quả bổ sung bột cà chua giầu lycopen trong thời gian 3 tháng (30 ngày/tháng) với các đối tượng thừa cân béo phì và rối loạn chuyển hóa lipid máu Có đánh giá . định kì tại các thời điểm: thời điểm To (ngay trước thử nghiệm) và T3 (sau 3 tháng thử nghiệm So sánh với hiệu quả sử dụng viên lyco). pen trong 3 tháng.
Đối tượng nghiên cứu được chia thành 3 nhóm: nhóm thử nghiệm gồm 2 nhóm: 1 nhóm sử dụng sản phẩm bột cà chua và 1 nhóm sử dụng viên lycopen với hàm lượng lycopen 10mg/ngày và 1 nhóm đối chứng sử dụng viên giả dược không có lycopen. Các đối tượng là những sĩ quan bị thừa cân béo phì, có rối loạn lipid máu được lựa chọn từ sau nghiên cứu của giai đoạn 1. Ba nhóm nghiên cứu được đánh giá bằng kích thước tương đương nhau, cùng một nhóm cán bộ nghiên cứu, có chỉ số BMI và tình trạng rối loạn lipid máu như nhau.
2.3.3. Cỡ mẫu
2. .3.1.3 Cỡ mẫu nghiên cứu mô tả thực trạng thừa cân béo phì và rối loạn lipid máu.
Cỡ mẫu thỏa mãn yêu cầu nghiên cứu về tỷ lệ mắc thừa cân béo phì và hội chứng chuyển hóa ở các đối tượng được xác định theo công thức 2.9.
n = Z2 ( 1-α/2) p(1 p)- (2.9) d2 Trong đó :
n: Số đối tượng cần điều tra tại cộng đồng.
d = 0,04 (độ chính xác mong muốn trong chọn mẫu) Z( 1-α/2)= 1,96 với khoảng tin cậy là 95%.
p: Tỷ lệ đối tượng có triglycerid cao ước tính dựa vào nghiên cứu của Viện Dinh dưỡng tại Hà Nội trên nhóm tuổi 25 – 64 là 29,5% [23].
Theo tính toán, tổng số đối tượng nghiên cứu sẽ là 0 người.50
Do đây là cuộc điều tra cắt ngang, lấy mẫu chùm nên để tăng độ tin cậy cần nhân đôi cỡ mẫu đã tính toán trên (DE: design effect =2) do đó cỡ mẫu được chọn là: 500 x 2 = 1.000 đối tượng.
Để đảm bảo mẫu trên được thỏa mãn yêu cầu nghiên cứu + 5% đối tượng dự phòng. Như vậy tổng số đối tượng nghiên cứu trong mẫu sẽ là 1050 người.Thực tế