Trong hầu hết các hệ thống phân loại vi khuẩn, những nhóm chính được phân biệt với nhau bởi những đặc điểm căn bản như hình dạng tế bào, phản ứng nhuộm Gram và khả năng sinh bào tử; các chi và loài thường được phân biệt bởi các đặc tính như các phản ứng lên men, nhu cầu dinh dưỡng và khả năng gây bệnh.
2.1. Thành phần DNA
Liên kết hydro giữa cặp bazơ guanine (G) và cytosine (C) trong phân tử DNA mạnh hơn so với liên kết hydro giữa cặp adenine (A) và thymine (T). Do vậy, nhiệt độ nóng chảy hay nhiệt độ biến tính (điểm nhiệt độ mà hai sợi tách rời nhau) được xác định chủ yếu bằng hàm lượng G+C. Tại nhiệt độ nóng chảy, việc tách rời hai mạch đơn DNA làm thay đổi rõ rệt độ hấp phụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm và điều này có thể dễ dàng nhận biết thông qua máy quang phổ kế. Vi khuẩn có sự đa dạng rất lớn ở hàm lượng G+C, thay đổi từ 26-80% mol ở các chi khác nhau. Tuy nhiên, với mỗi một loài nhất định, hàm lượng G+C là một con số tương đối ổn định, hoặc có thể thay đổi trong phạm vi rất hẹp nên giá trị này đã được sử dụng trong phân loại.
2.2. Mức độ tương đồng DNA
Một phương pháp phân loại khác nhằm sắp xếp các cá thể vào một nhóm phân loại nào đó dựa trên sự tương đồng về trình tự các cặp bazơ trên phân tử DNA của chúng. Phương pháp này dựa trên thực tế là sợi DNA kép có thể được tạo thành (bắt cặp) từ hai sợi đơn khi nâng hoặc hạ nhiệt độ tới nhiệt độ bắt cặp. Quá trình này diễn ra trên các phân tử DNA phân lập được từ một loài nhất định, tuy nhiên nó cũng có thể xảy ra trên các phân tử DNA ở hai loài có quan hệ họ hàng gần gũi để tạo thành những phân tử DNA lai. Quá trình bắt cặp lai này xảy ra
37
rất phổ biến trên các vùng bổ sung (vùng có trình tự giống nhau) trên phân tử DNA và mức độ lai này có thể được xác định nếu sử dụng các phân tử DNA đã được đánh dấu huỳnh quang. Những dữ liệu về quá trình liên kết với RNA thông tin (mRNA) cũng có thể đưa ra những thông tin bổ sung cho phương pháp phân loại này và nó cung cấp bằng chứng di truyền giữa các loài vi khuẩn có quan hệ họ hàng gần gũi. Những sinh vật có hàm lượng G+C khác nhau thì DNA của chúng không có sự tương đồng rõ rệt. Tuy nhiên, với những loài có hàm lượng G+C giống nhau hoặc gần bằng nhau thì cũng chưa chắc có sự tương đồng về trình tự DNA.
2.3. Giải trình tự RNA ribosome
Cấu trúc của RNA ribosome (rRNA) có tính bảo thủ cao (ổn định, ít thay đổi) trong quá trình tiến hóa và trình tự nucleotide mã hóa ra chúng cũng ít thay đổi nên dữ liệu này đã được sử dụng để xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài. Nhờ sự phát triển của công nghệ mà hiện nay việc giải trình tự nucleotide trở nên tương đối đơn giản và trình tự rDNA (và nhiều gene khác) của hầu hết các loài vi khuẩn có vai trò quan trọng trong y học đã được công bố trong cơ sở dữ liệu của nhiều website. Khi tiến hành phân loại, DNA của sinh vật cần xác định được tách chiết và sử dụng làm khuôn để nhân đoạn gene mã hóa rRNA. Đoạn DNA này sẽ được giải trình tự và tiến hành so sánh với cơ sở dữ liệu đã được công bố để tìm ra loài gần gũi nhất. Nếu độ tương đồng của trình tự từ loài phân lập với cơ sở dữ liệu nằm trong khoảng từ 0.5-1% thì được coi là một loài mới, chưa được xác định còn nếu độ tương đồng nhỏ hơn 97% thì được coi là hai loài khác biệt. Tuy nhiên các loài Mycobacterium khác nhau có thể có độ tương đồng về trình tự rDNA lớn hơn 97%.
Sự sai khác về trình tự rDNA đôi khi không đủ để phân biệt các loài có mức độ gần gũi cao. Do vậy, một số gene khác như recA (mã hóa một protein có vai trò trong quá trình sửa chữa và tái tổ hợp DNA), rpoB (mã hóa RNA polymerase),
groEL (mã hóa protein shock nhiệt), gyrB (mã hóa enzyme DNA gyrase),…