Khi đặt vào môi trường dinh dưỡng thích hợp và duy trì các điều kiện lý hóa phù hợp, một tế bào vi khuẩn sẽ bắt đầu sinh trưởng. Khi hàm lượng vật chất trong tế bào tăng xấp xỉ gấp hai lần, tế bào sẽ tiến hành phân chia. Các điều kiện phù hợp cho sinh trưởng vi khuẩn thay đổi trong phạm vi rất lớn, bao gồm toàn bộ sinh quyển trái đất, ngay cả ở các nơi có điều kiện về nhiệt độ và áp suất rất khắc nghiệt như tại các miệng núi lửa dưới đáy đại dương hay ở lớp khí quyển ngoài trái đất. Mặc dù những điều kiện sống khắc nghiệt như vậy không có ở cơ thể người, tuy nhiên điều đó cho thấy rằng không nơi nào trên cơ thể người hoặc trên các dụng cụ y tế là không thể phù hợp cho vi sinh vật phát triển và nó cũng chỉ ra rằng vi khuẩn có thể lẩn trốn ở các môi trường mà chúng ta không hề nghĩ tới. Ngược lại, các điều kiện cần cho một số vi sinh vật sinh trưởng lại rất nghiêm
50
ngặt mà cho tới nay chúng ta vẫn chưa tìm ra cách nuôi cấy chúng trên các môi trường nhân tạo, ở điều kiện phòng thí nghiệm. Chẳng hạn như chúng ta vẫn chưa tìm ra được phương pháp nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh phong và bệnh giang mai cũng như rất nhiều nhóm vi sinh vật khác mà phải sử dụng các phương pháp sinh học phân tử không thông qua nuôi cấy. Trên thực tế, các nhà khoa học ước tính rằng chúng ta mới chỉ phân lập và nuôi cấy được khoảng 1% trên tổng số các loài vi khuẩn tồn tại trên trái đất và chắc chắn rằng vẫn còn rất nhiều loài có vai trò quan trọng trong y học đang tồn tại mà chúng ta chưa biết đến.
Là một phương pháp chủ đạo trong vi khuẩn học, phương pháp nuôi cấy trong phòng thí nghiệm đã được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau. Đối với mục đích lâm sàng, phương pháp nuôi cấy được sử dụng để phát hiện và nhận biết, để đánh giá hiệu quả tác động của các chất kháng sinh. Trái lại, đối với mục đích nghiên cứu khoa học và trong công nghiệp thì nuôi cấy được tiến hành trên quy mô lớn để thu được lượng sinh khối lớn nhằm phân tích các hợp chất hóa học quan trọng cũng như để thu các sản phẩm dùng trong ngành sản xuất bia rượu và trong công nghiệp công nghệ sinh học.
1.1. Các kiểu sinh trưởng
Trong phòng thí nghiệm, sinh trưởng của vi khuẩn có thể được quan sát dưới 3 dạng chính sau:
Thông qua sự hình thành các khuẩn lạc. Mỗi khuẩn lạc là kết quả của việc phân bào 20-30 lần từ 1 tế bào ban đầu.
Thông qua sự thay đổi độ đục của môi trường nuôi cấy, từ dạng trong sang dạng đục chứa khoảng 107-109 tế bào/1 mL.
Thông qua sự hình thành màng sinh học. Đây là một lớp màng mỏng (300- 400 µm) bao phủ lên bề mặt quần thể vi sinh vật.
Trong tự nhiên thì chỉ có màng sinh học, giống như loại màng hình thành ở mặt trong của các loại ống truyền dịch, có vai trò giống như màng sinh học được tạo thành trong phòng thí nghiệm. Trái lại, đối với các khuẩn lạc thì chúng thường không phát triển thành dạng có kích thước lớn như ta quan sát thấy trong phòng thí nghiệm. Kiểu sinh trưởng dạng huyền phù trong môi trường lỏng của một vi khuẩn đơn lẻ cũng hiếm khi xảy ra trong tự nhiên. Những loại viêm nhiễm của một loại vi khuẩn ở các vị trí thường vô khuẩn trên cơ thể là một ngoại lệ, trái lại hầu hết quần xã vi sinh vật đều rất phức tạp bao gồm rất nhiều loài sống cạnh tranh nhau, đôi khi có thể hợp tác với nhau cùng tồn tại trong một vị trí. Tuy nhiên, việc nuôi cấy một loại vi khuẩn đơn lẻ trên môi trường để có được các khuẩn lạc có kích thước lớn hoặc thu được dung dịch vi khuẩn có mật độ cao có
51
những ý nghĩa quan trọng và là phương pháp chủ đạo trong các phòng thí nghiệm.
Trong khi chúng ta chú ý nhiều vào các đặc tính tự nhiên của vi khuẩn trong các điều kiện phòng thí nghiệm thì chúng ta có thể thấy rõ ràng rằng vi khuẩn thay đổi các đặc tính của chúng tùy thuộc các trạng thái sinh trưởng và không sinh trưởng và tùy thuộc vào các điều kiện môi trường nuôi cấy. Do vậy, khi chúng ta cố gắng điều trị hoặc tạo miễn dịch thông qua những đặc tính thu được trong điều kiện phòng thí nghiệm thì chúng ta thường thất bại vì sinh vật thường không biểu hiện những đặc tính đó. Điển hình như các trường hợp vi khuẩn tạo màng sinh học và những trạng thái vi khuẩn không sinh trưởng, không phân chia.
1.2. Các pha sinh trưởng trong môi trường lỏng
Sinh trưởng của vi khuẩn trong môi trường lỏng đã được nghiên cứu rất kỹ và các giai đoạn sinh trưởng hay các pha sinh trưởng của chúng đã được tổng kết lại bằng đường cong sinh trưởng (growth curve) lý tưởng như mô tả trong hình 4.1. Khi sinh trưởng được khởi động bằng việc đưa vi khuẩn vào môi trường và các điều kiện phù hợp thì số lượng vi khuẩn được duy trì không đổi trong một khoảng thời gian được gọi là pha thích ứng. Trong giai đoạn này, vi khuẩn thích nghi với các nguồn dinh dưỡng và chuẩn bị các điều kiện cho sinh trưởng. Giai đoạn kế tiếp có thể thấy rõ việc số lượng tế bào gia tăng nhanh chóng và đạt đến mức độ cực đại. Giai đoạn này được gọi là pha tăng trưởng theo cấp số mũ vì số lượng tế bào tăng theo cấp số mũ theo thời gian. Để có thể mô tả được sự thay đổi lớn về số lượng tế bào, đường cong sinh trưởng thường được biểu diễn dưới dạng logarith nên nó sẽ là một đường tăng tuyến tính dạng log của số lượng tế bào theo thời gian (vì vậy còn có tên gọi pha log). Mối tương quan tuyến tính dạng log này tương đối ổn định đối với một loài vi khuẩn nhất định trong một điều kiện sinh trưởng nhất định và nó có thể được mô tả bằng thời gian thế hệ hay thời gian cần thiết để số lượng vi khuẩn tăng gấp đôi (generation time hoặc
doubling time). Ví dụ, thời gian thế hệ của vi khuẩn tả Vibrio cholerae là 13 phút, còn của vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis là 24 giờ. Điều này không ngạc nhiên khi chúng ta thấy rằng người nhiễm tả có thể chết sau 12 giờ mắc bệnh còn vi khuẩn lao phải mất vài tháng để phát triển. Ngoài ra, khi phân lập các mẫu bệnh phẩm để tìm ra hai loài vi khuẩn trên thì đối với V. cholerae chỉ mất 1 ngày trong khi M. tuberculosis phải mất vài tuần mới thu được kết quả.
52
Hình 4.1. Các pha sinh trưởng của vi khuẩn trong môi trường lỏng Giai đoạn sinh trưởng theo cấp số mũ không thể diễn ra mãi trong các hệ thống đóng với lượng dinh dưỡng giới hạn. Do đó, cuối giai đoạn này tốc độ sinh trưởng giảm dần và số lượng tế bào đạt đến mức độ cực đại và duy trì ổn định. Giai đoạn này được gọi là pha cân bằng. Trong khoảng thời gian này chúng ta cần chú ý phương pháp mà chúng ta sử dụng để xây dựng đường cong sinh trưởng là gì. Nếu chúng ta sử dụng phương pháp đo trực tiếp tổng số lượng tế bào thì con số thu được là một hằng số (đường màu đỏ). Những phương pháp đo trực tiếp như đếm số lượng tế bào trong buồng đếm khi quan sát dưới kính hiển vi, đếm các hạt electron và đo độ đục của môi trường. Tuy nhiên, nếu chúng ta sử dụng phương pháp đếm thông qua việc thu mẫu đều đặn, pha loãng mẫu 10 lần và cấy trải mẫu pha loãng trên đĩa thạch thì chúng ta có thể đếm được số lượng đơn vị tạo khuẩn lạc (cfu) trong một đơn vị thể tích dịch nuôi cấy tại mỗi thời điểm nhất định (đường màu xanh). Mặc dù cách đếm khuẩn lạc này có giá trị tương đương so với cách đếm trực tiếp trong pha sinh trưởng theo cấp số mũ và giai đoạn đầu của pha cân bằng. Tuy nhiên, ở giai đoạn cuối của pha cân bằng, số lượng tế bào vẫn duy trì ổn định trong khi số lượng khuẩn lạc tạo thành bị suy giảm nhanh chóng. Điều này là do các tế bào bắt đầu chết do sự thiếu hụt các chất dinh dưỡng cũng như sự tích tụ của nhiều sản phẩm trao đổi chất gây độc đối với tế bào. Giai đoạn suy giảm số lượng khuẩn lạc tạo thành còn được gọi là pha suy tàn (decline phase).
53
Nghiên cứu sinh trưởng của vi khuẩn trong môi trường lỏng có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng đối với các quy trình xét nghiệm thông thường. Ví dụ, độ dài của pha lag và tốc độ của pha sinh trưởng theo cấp số mũ trong các điều kiện sinh trưởng khác nhau được sử dụng để dự đoán và góp phần xây dựng các quy chuẩn an toàn trong công nghiệp thực phẩm. Một điểm quan trọng cần chú ý là khi chúng ta nuôi cấy vi khuẩn ở các pha sinh trưởng khác nhau trên đường cong sinh trưởng thì kết quả thu được cũng khác nhau. Pha sinh trưởng theo cấp số mũ là giai đoạn tế bào hoạt động mạnh nhất, do vậy tế bào ở giai đoạn này thường được sử dụng để tiếp giống cho các mẻ nuôi cấy. Giai đoạn này có thể được kéo dài trong một hệ thống nuôi cấy mở được gọi là phương pháp nuôi cấy liên tục (continuous culture) sử dụng một chemostat (là một bioreactor cho phép thu nhận tế bào đang sinh trưởng và sản phẩm của chúng đồng thời bổ sung môi trường dinh dưỡng một cách liên tục). Nghiên cứu trong chemostat cung cấp những thông tin quan trọng về các đặc tính hóa học của sinh trưởng vi sinh vật và cho biết cách thức mà vi sinh vật chuyển hóa các nguồn cơ chất riêng biệt thành sinh khối. Hiệu quả của quá trình này đã khiến cho các vi sinh vật tự nhiên và vi sinh vật cải biến di truyền trở thành đối tượng cực kỳ quan trọng trong ngành công nghiệp công nghệ sinh học.
Trong khi chúng ta hiểu biết khá nhiều về sinh trưởng vi khuẩn trong môi trường lỏng thì các trạng thái sinh trưởng của các khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường thạch rắn lại rất hạn chế. Một khuẩn lạc mọc trên dải môi trường khác nhau, từ vị trí có đầy đủ các chất dinh dưỡng và oxy ở phía cạnh tới vị trí gần như thiếu hụt hoàn toàn chất dinh dưỡng và oxy ở vị trí trung tâm. Dường như tất cả các pha sinh trưởng của các tế bào đều tồn tại trên khuẩn lạc, phụ thuộc vào vị trí cụ thể của một tế bào nhất định và tùy thuộc vào thời gian nuôi cấy. Mặc dù trong thực nghiệm, khuẩn lạc có thể được dùng để đánh giá hiệu quả tác động của các chất kháng sinh, tuy nhiên, chúng không thể được chọn để tiếp giống cho các thí nghiệm nuôi cấy khác vì khuẩn lạc chứa quần thể tế bào ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Trên thực tế, khuẩn lạc là một quần xã năng động và phức tạp trong đó các tế bào ở các vị trí khác nhau thể hiện những kiểu hình khác nhau. Mặc dù khuẩn lạc có độ phức tạp cao, tuy nhiên khả năng và chất lượng của khuẩn lạc một loài vi khuẩn nào đó mọc trên một môi trường đặc hiệu lại đóng vai trò trung tâm khi mô tả về đặc tính của các loài vi khuẩn có ý nghĩa quan trọng đối với y học.