Định typ vi khuẩn

Những loài vi khuẩn khác nhau thường có những cấu trúc quần thể khác nhau. Một số loài được xác định là có sự đa dạng quần thể cao. Tần số tái tổ hợp các gene trên nhiễm sắc thể được xem là yếu tố quyết định chính tới cấu trúc quần thể của một loài nào đó và biên độ tần số thay đổi từ không tới thấp và tới rất cao. Những quần thể có mức độ tái tổ hợp gene cao được gọi là quần thể giao phối ngẫu nhiên (panmictic population), trái ngược với quần thể vô tính (clonal population) có mức độ tái tổ hợp rất thấp. Những loài như Neisseria gonorrhoeae

(tác nhân gây bệnh lậu) và Haemophilus influenzae (vi khuẩn cơ hội gây ra các viêm nhiễm đường hô hấp, viêm màng não mủ) là những loài có tính khả biến tự

45

nhiên, có nghĩa là chúng có thể thu nhận các phân tử DNA từ môi trường ngoài, và những quần thể này có tần số tái tổ hợp cao, các alen tồn tại riêng biệt và tần số đột biến tương đối thấp. Ở các quần thể vô tính như Salmonella enterica (gây bệnh thương hàn), tái tổ hợp hiếm khi xảy ra và có sự kết hợp không ngẫu nhiên giữa các alen trên nền tảng di truyền ổn định. Đột biến xảy ra là kết quả của áp lực chọn lọc tự nhiên nhưng đó không phải là điều kiện đủ để thay đổi một dòng tế bào và các tế bào con cháu vẫn tiếp tục duy trì tính trạng giống với tổ tiên ban đầu. Do đó, các dòng vi khuẩn không giống hoàn toàn với bố mẹ chúng nhưng chúng lại có một số đặc điểm chung với tổ tiên.

Bằng cách định typ vi khuẩn, chúng ta xác định được các phân nhóm riêng biệt của một loài và làm cơ sở để so sánh các chủng khác nhau của loài đó. Một quần thể vi khuẩn phát triển từ một tế bào ban đầu được gọi là một dòng vi

khuẩn (strain). Mỗi quần thể vi khuẩn phát triển từ môi trường nuôi cấy sơ cấp từ nguồn mẫu tự nhiên được gọi là một chủng phân lập (isolate). Nhận biết được sự khác biệt giữa dòng và chủng phân lập rất quan trọng, ví dụ, các mẫu nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh thương hàn phân lập được từ 10 bệnh nhân khác nhau được hiểu một cách đơn giản là 10 chủng phân lập khác nhau, trừ trường hợp các bằng chứng dịch tễ học hoặc các bằng chứng khác chỉ ra rằng những bệnh nhân đó bị nhiễm từ một nguồn chứa một dòng vi khuẩn chung. Các dòng vi khuẩn khác nhau cũng có thể được phân biệt chỉ bằng một vài đặc điểm nhỏ, còn phân biệt sự khác nhau giữa các chủng phân lập từ một nguồn giống nhau thậm chí còn đơn giản hơn.

6.1. Định typ huyết thanh (serotyping)

Rất nhiều cấu trúc bề mặt tế bào vi khuẩn (lipopolysaccharide, lớp màng ngoài, lông roi, vỏ capsule,…) có tính kháng nguyên, và các kháng thể kháng lại chúng có thể được sử dụng để nhóm các chủng phân lập thành các typ huyết thanh (serotype). Các thành viên thuộc loài Salmonella enterica được phân biệt bởi các typ huyết thanh lông roi. Các kháng nguyên vỏ capsule cũng có thể liên quan tới khả năng gây bệnh của sinh vật và đã có rất nhiều loại vắc xin được tạo ra để kích thích sản sinh kháng thể kháng lại các kháng nguyên vỏ capsule. Hiện tượng ngưng kết dịch khuẩn với các kháng thể thỏ thường được sử dụng để định typ vi khuẩn nhưng một số kỹ thuật khác như ngưng kết trên thạch, ELISA, phản ứng phồng vỏ capsule cũng có thể được sử dụng.

6.2. Định typ độc tố vi khuẩn (bacteriocin typing)

Độc tố vi khuẩn là các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên được tạo ra bởi hầu hết các loài vi khuẩn, có vai trò ức chế sinh trưởng đối với các loài có quan hệ họ

46

hàng gần với loài sinh ra độc tố. Định typ độc tố vi khuẩn có thể xác định phổ các độc tố bởi các dòng vi khuẩn ngoài tự nhiên hoặc mức độ nhạy cảm của các dòng vi khuẩn này đối với các độc tố sinh ra bởi một số dòng chuẩn.

6.3. Định typ enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease typing)

Enzyme cắt giới hạn là một họ các enzyme mà mỗi loại có khả năng cắt phân tử DNA tại những trình tự nhận biết đặc hiệu. Các trình tự nhận biết này có thể xuất hiện nhiều hoặc ít, tùy thuộc vào từng loài sinh vật. Tần số xuất hiện điểm cắt của một enzyme giới hạn phụ thuộc vào từng trình tự nucleotide và vào phần trăm hàm lượng G+C. Ví dụ, điểm nhận biết đặc hiệu của enzyme SmaI là 5’- CCCGGG-3’ ( là vị trí cắt) và những điểm cắt này rất ít xuất hiện trong hệ gene giàu AT như ở Staph. aureus, trái lại enzyme XbaI (5’-TCTAGA-3’) lại rất ít xuất hiện ở những loài vi khuẩn Gram âm có hàm lượng GC cao. Các enzyme cắt giới hạn cắt phân tử DNA thành rất nhiều đoạn DNA nhỏ hơn và những đoạn nhỏ này có thể được phân tách và nhận biết bằng phương pháp điện di trên gel agarose (Hình 3.1).

Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm cắt DNA của Ps. aeruginosa bằng XbaI

6.4. Định typ bằng phương pháp PCR

PCR (Polymerase chain reaction) là một phương pháp cho phép nhân một đoạn DNA đặc hiệu nào đó. Rất nhiều bản sao của một vùng nào đó trên hệ gene được nhân lên nhờ các đoạn mồi đặc hiệu thông qua các chu trình nhiệt được kiểm soát chặt chẽ. Hiện có rất nhiều phương pháp cải tiến dựa trên nguyên lý

47

của PCR đã được áp dụng và ngày càng phát triển. Để tiến hành định typ bằng PCR chúng ta cần biết về trình tự nucleotide của đoạn DNA cần nhân lên để thiết kế được các đoạn mồi phù hợp. Các đoạn mồi này có thể là đặc hiệu cho một vùng nhất định hoặc có thể là ngẫu nhiên. Các đoạn mồi ngẫu nhiên (random primers) được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) và AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR).

6.5. Định typ dựa trên toàn bộ hệ gene

Sự phát triển vượt bậc của phương pháp giải trình tự DNA đã mở ra một kỷ nguyên mới mà ở đó chúng ta có thể so sánh các type vi khuẩn dựa trên dữ liệu trình tự của toàn bộ hệ gene của chúng. Chi phí để giải trình tự toàn bộ hệ gene của sinh vật ngày càng giảm nên phương pháp định typ dựa trên dữ liệu toàn bộ hệ gene có thể cạnh tranh với các phương pháp định typ truyền thống. Sau khi đã có dữ liệu thô về trình tự toàn bộ hệ gene, các nhà khoa học sử dụng các phương pháp tin sinh học để phân tích, so sánh và xác định chức năng của các đoạn trình tự. Các phân tích này có vai trò quan trọng trong vi sinh y học vì nó cho biết các thông tin dịch tễ học rất rõ ràng cũng như nhận biết được các yếu tố di truyền chẳng hạn như các gene kháng kháng sinh hay gene mã hóa cho những kháng nguyên quan trọng.

Một số website tham khảo

 Genotyping database at Oxford University http://www.mlst.net/

 National Center for Biotechnology information for rRNA sequence analysis http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/

 Ribosomal differentiation of medical microorganisms for rRNA sequence analysis http://www.ridom-rdna.de/

 Universal virus database of the International Committee on Taxonomy of Viruses http://www.ictvdb.org/

Chương 4. Các đặc tính sinh trưởng, sinh lý của vi khuẩn

Những nội dung quan trọng

 Các đặc điểm sinh trưởng và sinh sản của vi khuẩn là những thông tin quan trọng trong việc phát hiện và nhận biết các tác nhân gây bệnh, và chúng thường là các yếu tố cần thiết cho quá trình lây nhiễm.

48  Vi khuẩn sinh sản theo lối vô tính bằng cách chia đôi tế bào. Trong môi

trường lỏng, vi khuẩn sinh trưởng qua các giai đoạn thích ứng (lag phase), giai đoạn sinh trưởng theo cấp số mũ (exponential phase) và giai đoạn cân bằng (stationary phase). Sinh trưởng của vi khuẩn cũng có thể nhận biết dưới dạng khuẩn lạc (colony) hoặc màng sinh học (biofilm). Một dòng vi khuẩn nhất định cũng có thể có các đặc điểm sinh lý rất khác nhau ứng với mỗi trạng thái sinh trưởng như trên.

 Phương pháp nuôi cấy làm thuần vi khuẩn được thực hiện trên môi trường thạch rắn. Các loại môi trường khác nhau được tạo ra để chọn lọc, làm giàu và nhận biết các điều kiện sinh trưởng của vi khuẩn.

 Các loại vi khuẩn khác nhau đã tiến hóa để tồn tại và sinh trưởng trong rất nhiều môi trường sống khác nhau. Biết được những môi trường sống cho từng loài sẽ giúp xác định những nguồn lây nhiễm tiềm tàng. Các điều kiện cho sinh trưởng của các loài vi khuẩn khác nhau là những yếu tố quan trọng để phân biệt nhóm vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, kỵ khí bắt buộc, vi hiếu khí và kỵ khí tùy tiện.

 Khả năng sống của vi khuẩn được được nhận biết và định lượng bằng cách xác định sự sinh trưởng từ một tế bào ban đầu thành một khuẩn lạc thông qua chỉ số cfu (colony-forming unit). Sự khác nhau giữa cfu và số lượng các tế bào quan sát được trên kính hiển vi dựa trên một thực tế là có rất nhiều các tế bào trong mẫu thu được từ tự nhiên không có khả năng tạo thành khuẩn lạc.

 Vi khuẩn có thể bị chết thông qua quá trình lão hóa ở giai đoạn cân bằng, có thể do được lập trình sẵn trong vật chất di truyền hoặc do các gene của thể thực khuẩn gây chết hoặc do các yếu tố ngoại sinh như ảnh hưởng của các chất kháng sinh, các phương pháp khử trùng, tẩy trùng.

 Khử trùng hay tiệt trùng (sterilization) là phương pháp tiêu diệt toàn bộ các sinh vật sống có trong mẫu còn tẩy trùng (disinfection) liên quan đến việc làm giảm lượng vi sinh vật tới mức độ không thể lây nhiễm được nữa. Cả hai quá trình có thể được thực hiện bằng các phương pháp nhiệt khô, nhiệt ẩm, sử dụng tia phóng xạ ion hóa, sử dụng màng lọc khuẩn, các chất hóa học dạng khí, dạng dung dịch.

Hầu hết những hiểu biết của chúng ta về vi sinh vật đều thu được từ cách thức mà vi sinh vật sinh trưởng. Khả năng sinh trưởng, sinh sản của vi sinh vật giúp chúng đạt được số lượng cực lớn với tốc độ sinh sản mà con người không thể tưởng tượng nổi. Những đặc điểm này đã củng cố khả năng biến đổi của vi sinh vật thông qua đột biến.

49

Sinh trưởng của vi khuẩn bao gồm cả việc tăng kích thước tế bào và tăng số lượng tế bào. Ở bất cứ trạng thái cân bằng nào của hai quá trình này thì kết quả cuối cùng cũng làm tăng tổng sinh khối (biomass) của quần thể nuôi cấy. Các nhà vi sinh vật y học khi nghiên cứu sinh trưởng vi sinh vật thường tập trung vào số lượng các các thể. Liệu việc chỉ đề cập tới số lượng tế bào có phù hợp hay không thì vẫn còn chưa rõ, tuy nhiên, chúng ta có thể thấy rằng do số lượng cá thể vi khuẩn có vai trò quan trọng trong quá trình lây nhiễm và hậu quả của lây nhiễm và trong việc đo hiệu quả của các chất kháng sinh.

Sinh viên ngành y có thể ngạc nhiên và thậm chí có thể hoảng hốt khi nghe thấy rằng những sinh vật có kích thước nhỏ như vi khuẩn lại có một ngành sinh lý học riêng. Tuy nhiên, sự tồn tại của các loại enzyme và các quá trình sinh hóa, sinh lý xảy ra ở tế bào prokaryote tại bất kỳ một thời điểm nào cho thấy chúng là

những sản phẩm của di truyền và các cơ chế kiểm soát sinh hóa rất chặt chẽ như ở các tế bào eukaryote. Hơn nữa, việc nhận biết và xác định được các cơ chế mà vi sinh vật sử dụng để cảm ứng và thích nghi với những kích thích về dinh dưỡng, về điều kiện bất lợi sẽ cho chúng ta những hiểu biết cách thức mà các vi sinh vật có hại phản ứng trong quá trình gây bệnh.

Mặc dù chương này chỉ bàn luận về sinh trưởng và sinh lý của vi khuẩn, tuy nhiên, một số nguyên lý cũng có thể được áp dụng vào nấm, đặc biệt là nấm men (yeast). Điểm khác biệt chính về sinh trưởng giữa các nhóm này là cách thức phân chia tế bào ở vi khuẩn là theo cách phân đôi để tạo ra hai tế bào con giống nhau và giống với tế bào mẹ ban đầu, ngược lại, nấm phân bào theo lối nảy chồi như ở nấm men và theo kiểu tạo sợi như ở nấm mốc. Trái lại, các cơ chế tiệt trùng và tẩy trùng lại giống nhau đối với toàn bộ tác nhân lây nhiễm.