5.1. Phương pháp phân tích gene đích
Phương pháp này sử dụng những đoạn DNA để nhận biết các đoạn bổ sung với nó có trong hệ gene của vi sinh vật cần xác định. Việc liên kết giữa chúng được nhận biết bằng cách đánh dấu đoạn DNA bằng phóng xạ hoặc bằng một loại thuốc thử cho phản ứng tạo màu, ví dụ như biotin. Bằng việc chọn lọc những đoạn DNA đặc hiệu cho một loài vi sinh vật cần nhận biết mà quá trình nhận diện được tiến hành rất nhanh chóng. Nhược điểm của phương pháp này là sinh vật trong mẫu có thể bị chết vì vậy không thể tiến hành các xét nghiệm tiếp theo, chẳng hạn như
42
xét nghiệm đánh giá khả năng kháng thuốc kháng sinh, khả năng sinh độc tố hoặc các nghiên cứu dịch tễ học.
Việc nhận biết thông qua nuôi cấy vi khuẩn lại rất mất thời gian và phụ thuộc vào từng phòng thí nghiệm. Ngoài ra, cũng có thể không nuôi cấy được vi khuẩn, vi khuẩn sinh trưởng rất chậm, hoặc chúng đòi hỏi sử dụng nguồn dinh dưỡng đặc biệt. Vì thế những kỹ thuật dựa trên acid nucleic để phát hiện và nhận diện được vi khuẩn đã được phát triển để khắc phục những nhược điểm trên. Hiện nay, đã có rất nhiều hệ thống, thiết bị phát hiện và nhận diện vi khuẩn có mặt trên thị trường và được sử dụng phổ biến trong rất nhiều phòng thí nghiệm chẩn đoán.
Hiện nay chúng ta có thể phát hiện sự có mặt của một loài vi sinh vật nào đó bằng phương pháp PCR một gene đặc hiệu hoặc bằng phương pháp lai với mẫu dò đặc hiệu. So với các phương pháp thông thường, công nghệ dựa trên acid nucleic cũng có những hạn chế của nó, điển hình là việc mẫu bị lẫn tạp và cho ra những sản phẩm nhiễu. Những yếu tố khác có thể ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm như kỹ năng thao tác của kỹ thuật viên, kỹ năng lựa chọn và thiết kế mồi (primer), sự có mặt của các chất ức chế phản ứng trong mẫu xét nghiệm,…Tuy nhiên, các công nghệ mới hiện nay đã được phát triển làm tăng độ nhạy và nhiều quy trình PCR được tối ưu hóa để có thể phát hiện được từ 2-10 tế bào vi khuẩn trong 1 mL mẫu xét nghiệm (nhỏ hơn rất nhiều so với số lượng tế bào cần thiết để phát hiện được bằng phương pháp nuôi cấy thông thường). Những kỹ thuật mới bao gồm micro-Array, real-time PCR, FISH (Fluorescen in-situ hybridization) có độ nhạy rất cao, vừa có thể phát hiện và vừa định lượng được số lượng tế bào vi khuẩn có trong mẫu nhờ vào các tín hiệu huỳnh quang.
5.2. Các phản ứng kháng thể
Các loài hoặc chủng vi sinh vật thường được nhận biết bằng các phản ứng huyết thanh đặc hiệu. Kỹ thuật này dựa trên thực tế là trong huyết thanh của một loài động vật miễn dịch với một loại vi sinh vật nào đó có chứa các kháng thể đặc hiệu cho các loài hoặc chủng tương đồng và chúng phản ứng ngưng kết với loài vi sinh vật đó. Xét nghiệm in-vitro đơn giản này đã được các nhà vi sinh vật học sử dụng từ nhiều năm qua, điển hình là trong xét nghiệm tìm ra các chủng vi sinh vật gây bệnh có trong các mẫu bệnh phẩm (phát hiện salmonella). Độ đặc hiệu và các loại xét nghiệm kháng thể đã được cải tiến lên nhiều nhờ việc phát hiện ra sự tồn tại của các loại kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) đặc hiệu cao. Kháng thể đơn dòng là các sản phẩm của kỹ thuật lai giữa các tế bào lách sinh kháng thể riêng biệt với các tế bào khối u. Các tế bào lai con cháu được tạo ra sẽ sản sinh ra loại các kháng thể giống với loại được sinh ra từ tế bào lách ban đầu.
43
5.3. Phản ứng ngưng kết Latex
Bằng việc hấp phụ các kháng thể đặc hiệu lên bề mặt các hạt latex cố định để phát hiện sự tồn tại của các kháng nguyên tương đồng thông qua phản ứng ngưng kết latex. Người ta cũng có thể làm ngược lại, tức là gắn các kháng nguyên lên bề mặt các hạt latex để phát hiện sự tồn tại của các kháng thể tương ứng có trong huyết thanh. Rất nhiều loại kít sử dụng latex đã được phát triển và sử dụng để phân loại các vi sinh vật cũng như phát hiện các độc tố được tạo ra trong quá trình sinh trưởng của vi khuẩn.
5.4. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
Trong xét nghiệm này, một kháng thể đặc hiệu được cố định vào bề mặt một giếng nhựa và sau đó chất có chứa kháng nguyên cần kiểm tra sẽ được bổ sung vào. Sau bước rửa, sự có mặt của kháng nguyên được phát hiện bằng việc tiếp tục bổ sung các kháng thể đặc hiệu có gắn với một loại enzyme xúc tác cho phản ứng tạo màu khi bổ sung loại cơ chất phù hợp. Cường độ thay đổi màu có tương quan với lượng kháng nguyên liên kết vào. Phương pháp ELISA cũng có thể được sử dụng theo cách ngược lại để phát hiện ra sự tồn tại của các kháng thể bằng cách gắn các kháng nguyên tinh sạch vào các giếng nhựa trước khi bổ sung dịch huyết thanh có chứa kháng thể vào. Trong trường hợp này, hệ liên kết
enzyme để phát hiện phản ứng kháng nguyên-kháng thể là một chất kháng kháng thể (anti globulin) đã được đánh dấu. Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể IgM (MAC-ELISA), được sử dụng rộng rãi trong xét nghiệm virus để phát hiện kháng thể IgM, kháng kháng thể IgM (thường được tạo ra từ dê) được gắn vào giếng. Tiếp theo, huyết thanh cần xét nghiệm được bổ sung vào và các IgM sẽ liên kết với kháng kháng thể. Sau bước rửa, kháng nguyên tinh sạch (ví dụ kháng nguyên rubella) được thêm vào và được phát hiện bằng một kháng thể đánh dấu phù hợp.
5.5. Phản ứng ngưng kết hồng cầu và hấp phụ hồng cầu
Một số loài virus, chẳng hạn như các loại virus cúm, có khả năng liên kết đặc hiệu với các thụ thể trên bề mặt tế bào hồng cầu. Theo cách này, virus đóng vai trò là cầu liên kết các tế bào hồng cầu tụ lại tạo thành khối. Trong dung dịch nuôi cấy mô, những phản ứng ngưng kết hồng cầu có thể xảy ra trên bề mặt của các tế bào bị nhiễm virus. Nếu các tế bào hồng cầu được bổ sung vào dịch nuôi cấy mô thì chúng sẽ dính vào bề mặt của các tế bào bị nhiễm virus, hiện tượng này được gọi là hấp phụ hồng cầu (hemadsorption). Tế bào hồng cầu cũng có thể được bọc bằng các kháng thể đặc hiệu vì vậy chúng có thể ngưng kết lại khi có
44
mặt của các hạt virus tương đồng theo cách thức tương tự như đã được mô tả trong phương pháp ngưng kết latex phía trên.
5.6. Sử dụng kính hiển vi huỳnh quang và miễn dịch huỳnh quang
Khi một loại thuốc nhuộm được đặt dưới ánh sáng tử ngoại, chúng hấp thụ năng lượng và phát ra ánh sáng nhìn thấy, và người ta gọi chúng là chất phát huỳnh quang. Các mô hoặc các sinh vật được nhuộm bởi một loại thuốc nhuộm như vậy và được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại phát ra từ nguồn sáng tích hợp trong một loại kính hiển vi được thiết kế phù hợp thì chúng sẽ hiện lên dưới dạng các vật phát huỳnh quang. Ví dụ, uramine được sử dụng để nhuộm vi khuẩn lao
Mycobacterium tuberculosis. Các phân tử kháng thể cũng có thể được đánh dấu bằng cách gắn với các chất phát huỳnh quang. Khi các phân tử kháng thể này phản ứng với các kháng nguyên tương ứng có trên bề mặt tế bào thì phản ứng này được gọi là miễn dịch huỳnh quang trực tiếp và nó được sử dụng để phát hiện ra những kháng nguyên đặc hiệu nào đó với độ nhạy rất cao.
5.7. Phương pháp PCR miễn dịch
Đây là kỹ thuật có sự kết hợp giữa công nghệ kháng thể và phương pháp PCR với mục đích làm tăng cường khả năng phát hiện kháng nguyên. Trong
phương pháp này, một phân tử cầu nối, có khả năng liên kết đặc hiệu với cả DNA và kháng thể, được sử dụng để gắn kết một phân tử DNA (một marker) vào một phức hợp kháng nguyên-kháng thể. Phản ứng này tạo thành một phức hợp kháng nguyên-kháng thể-DNA. Đoạn DNA này sau đó được nhân lên bằng phương pháp PCR khi sử dụng cặp mồi phù hợp và sự có mặt của sản phẩm PCR chứng tỏ đoạn DNA marker đã được gắn vào phức hợp kháng nguyên-kháng thể và cho thấy sự tồn tại của kháng nguyên. Phương pháp này có độ nhạy cao hơn ELISA gấp 105
lần.