Việc nhận biết chính xác vi khuẩn là một công việc mất nhiều thời gian và cần được tiến hành trong các phòng thí nghiệm chuyên biệt. Với lĩnh vực lâm sàng, việc xác định rõ ràng, nhanh chóng nguyên nhân của một bệnh truyền nhiễm nào đó là cần thiết vì vậy các nhà vi sinh vật học thường dựa vào một vài quy trình đơn giản, chủ yếu dựa trên việc sử dụng kính hiển vi và dùng phương
40
pháp nuôi cấy và một vài thí nghiệm phụ trợ để nhận biết sơ bộ về tác nhân gây bệnh. Kính hiển vi là công cụ nhận biết nhanh nhất trong hầu hết các trường hợp, còn việc tiến hành nuôi cấy thì nhanh nhất cũng phải mất 24 giờ, thậm chí lâu hơn. Các thử nghiệm nhanh hơn như phương pháp phát hiện kháng nguyên hay phương pháp sinh học phân tử hiện nay đã được sử dụng phổ biến.
Hầu hết các mẫu xét nghiệm vi sinh vật có thể từ người, động vật hay từ môi trường đều chứa hỗn hợp nhiều loại vi sinh vật. Vì vậy cần phải tiến hành việc nuôi cấy phân tách ra các chủng riêng biệt trước khi tiến hành việc nhận diện mỗi loại. Các phương pháp không cần phải nuôi cấy như phương pháp phát hiện kháng nguyên hoặc phát hiện các đặc tính di truyền đã hạn chế được khó khăn trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên những người thực hiện phương pháp này lại phải có những kiến thức chuyên sâu trong lĩnh vực phân loại vi sinh vật.
4.1. Phương pháp soi kính
Hình dáng và đặc tính bắt màu với các loại thuốc nhuộm là những dữ liệu đầu tiên để chúng ta xếp một loài chưa biết vào một nhóm phân loại phù hợp. Phương pháp nhuộm Gram cho chúng ta biết về cấu trúc thành tế bào, kích thước, hình dạng và sự sắp xếp các nội bào tử ở vi khuẩn. Lớp capsule bao quanh tế bào vi khuẩn được nhận biết bằng phương pháp nhuộm âm sử dụng mực Ấn vì lớp capsule không bắt màu với mực. Để nhận biết mycobacteria và các vi khuẩn acid-fast khác thì người ta sử dụng thuốc nhuộm Ziehl-Neelsen. Đặc tính hiển vi của một số sinh vật nào đó có trong các mẫu bệnh phẩm có thể được sử dụng để nhận biết sơ bộ về mầm bệnh. Tuy nhiên, rất nhiều loài vi khuẩn có hình dạng tương tự nhau, vì thế cần phải tiến hành thêm một số phương pháp khác mới có thể phân biệt được chúng.
4.2. Phương pháp nuôi cấy
Hình thái của các khuẩn lạc vi khuẩn mọc trên bề mặt môi trường thạch dinh dưỡng thường có sự khác biệt rõ rệt. Đường kính, độ dày, độ đục và màu sắc của khuẩn lạc thường được so sánh và đối chiếu để nhận biết các nhóm khác nhau. Những thay đổi trong môi trường lỏng dùng để nuôi cấy vi sinh vật cũng rất quan trọng (ví dụ như khả năng làm tan máu trong môi trường thạch máu). Khả năng vi sinh vật có thể hoặc không thể sinh trưởng trong môi trường có oxy (hiếu khí), không có oxy (kỵ khí), chứa ít oxy (vi hiếu khí), chứa CO2, hoặc trong môi trường có chứa các nhân tố ức chế chọn lọc (muối mật, chất kháng sinh, pH cao hoặc thấp) cũng là các yếu tố quan trọng trong chẩn đoán.
41
4.3. Các phương pháp sinh hóa
Những loài không thể phân biệt được nếu chỉ dựa vào hình thái và các đặc điểm nuôi cấy thì có thể có những đặc điểm trao đổi chất khác nhau. Thông thường người ta sẽ kiểm tra xem sinh vật đó có tạo ra các sản phẩm có tính acid hoặc chất khí nào không khi nuôi cấy trên môi trường chỉ chứa một nguồn
carbohydrate duy nhất (glucose, lactose, sucrose, mannitol,…). Những xét nghiệm khác được tiến hành để xác định xem sinh vật đó có tạo ra sản phẩm đặc trưng nào đó không (indole, H2S) khi nuôi cấy trên môi trường thích hợp hoặc khả năng sinh ra những enzyme nhất định chẳng hạn như catalase, oxidase, urease,
gelatinase hoặc lecithinase. Thông thường, những xét nghiệm này được tiến hành có chọn lọc và riêng rẽ dựa trên các hướng dẫn cụ thể như được trình bày trong cuốn “Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria”. Tuy nhiên, hiện nay hầu hết các phòng thí nghiệm chẩn đoán sử dụng các bộ kít thương mại để xác định nhanh và chính xác các loài vi sinh vật mặc dù chi phí tương đối cao. Các kít xét nghiệm đã được phát triển để nhận biết rất nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như enterobacter, staphylococci, streptococci và các nhóm vi khuẩn kỵ khí khác. Một số loại kít khác kiểm tra khả năng sử dụng các nguồn carbon, khả năng đồng hóa một nguồn cơ chất nào đó hoặc khả năng tạo ra các enzyme đặc hiệu.
Trong một vài trường hợp, các phương pháp chính xác hơn được tiến hành để phân tích các sản phẩm trao đổi chất hoặc phân tích toàn bộ lượng acid béo trong tế bào. Cụ thể, có thể sử dụng hệ thống tự động phân tích lượng acid béo như hệ thống sắc ký khí hiệu năng cao và phần mềm phân tích để nhận biết rất nhiều vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí. Các phương pháp khối phổ cũng đã được sử dụng để nhận biết vi sinh vật và cho ra kết quả nhanh chóng, có độ chính xác cao. Phương pháp này cần tiến hành phân tích toàn bộ môi trường nuôi cấy sinh vật để tìm ra những sản phẩm đặc trưng của từng loài.