Kỹ thuật sắc ký miễn dịch có nguyên lý của phản ứng miễn dịch nhƣ của kỹ thuật ELISA và có rất nhiều biến thể nhƣng thƣờng đƣợc chia làm hai loại chính là kỹ thuật kẹp đôi (sandwich assay) và kỹ thuật cạnh tranh (competitive assay).
* Phản ứng theo dạng sandwich (sandwich assay)
Que thử dạng này thƣờng đƣợc sử dụng để phát hiện các chất phân tích có bản chất protein, có phân tử lƣợng lớn với nhiều vị trí gắn kháng nguyên nhƣ hCG, kháng nguyên Dengue, Hemoglobine,...[88] Chất cần phân tích vừa liên kết đƣợc với kháng thể cộng hợp màu, vừa liên kết đƣợc với kháng thể tại vạch thử nghiệm. Tại vị trí vạch thử nghiệm, cố định một kháng thể thứ hai có khả năng bắt cặp với kháng nguyên cần phát hiện (khác với kháng thể cộng hợp có màu). Nếu các độc tố có mặt trong mẫu phân tích, chúng sẽ tƣơng tác với kháng thể cộng hợp, tạo thành phức hợp kháng
38
nguyên - kháng thể cộng hợp có màu. Dƣới tác dụng của lực mao dẫn, dung dịch sẽ chuyển dịch đến vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng rồi di chuyển về phía giấy thấm hút lên trên que thử. Phức hợp kháng nguyên - kháng thể cộng hợp khi chuyển động đến vị trí vạch thử nghiệm sẽ bị giữ lại nhờ liên kết của kháng thể vạch thử nghiệm với kháng nguyên. Sự xuất hiện của vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử chứa SE. Nhƣ vậy, trong trƣờng hợp dƣơng tính, có độc tố trong mẫu phân tích, thì sẽ xuất hiện hai vạch màu. Ngƣợc lại chỉ có một vạch màu trong trƣờng hợp âm tính. Hình 1.8, thể hiện nguyên tắc hoạt động và đánh giá kết quả của phản ứng theo dạng sandwich.
Ƣu điểm của sắc ký miễn dịch kẹp đôi là độ nhạy và độ đặc hiệu cao do sử dụng tới hai kháng thể có khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên ở những vị trí khác nhau. Tuy nhiên, phƣơng pháp sắc ký miễn dịch kẹp đôi không phải lúc nào cũng thực hiện đƣợc vì cần sử dụng hai kháng thể nhận biết hai vị trí kháng nguyên khác nhau khi không bị cản trở bởi không gian. Hơn nữa, nhƣợc điểm của nó là khó có khả năng phát hiện đƣợc cả 5 loại độc tố tụ cầu phổ biến hiện nay: SEA, SEB, SEC, SED, SEE, do trên thị trƣờng chƣa có một cặp kháng thể nào có thể bắt cặp với cả 5 loại kháng nguyên trên.
39
Hình 1.8. Sắc ký miễn dịch kẹp đôi
* Phản ứng theo dạng cạnh tranh (competitive assay):
Que thử theo dạng này đƣợc sử dụng khi cần phát hiện các phân tử nhỏ với tính quyết định kháng nguyên duy nhất, mà không thể liên kết với 2 kháng thể cùng một lúc, ví dụ nhƣ các loại que thử chẩn đoán các loại thuốc gây nghiện, các steroid,... Chất phân tích sẽ di chuyển nhanh và cạnh tranh liên kết với chất cộng hợp màu tại vạch thử nghiệm. Tại vị trí vạch thử nghiệm, một kháng thể có khả năng bắt cặp với kháng nguyên cần phát hiện đƣợc cố định. Trong trƣờng hợp này, cộng hợp sẽ là kháng nguyên gắn với hạt nano vàng hoặc nano carbon. Nếu độc tố không có mặt trong mẫu phân tích thì khi dung dịch di chuyển về phía vùng chứa các kháng thể cố định, kháng nguyên cộng hợp sẽ tƣơng tác với kháng thể tạo thành phức hợp kháng thể - kháng nguyên cộng hợp có màu ở vị trí vạch thử nghiệm của que thử. Sự xuất hiện vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử không có chứa SE. Ngƣợc lại, nếu trong mẫu phân tích có SE thì chúng cạnh tranh với kháng nguyên cộng hợp về việc bị giữ lại ở vị trí vạch thử nghiệm. Sự không xuất hiện của vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử chứa SE. Nhƣ vậy, trong trƣờng hợp dƣơng tính, có độc tố trong mẫu phân
40
tích, thì sẽ xuất hiện một vạch màu. Ngƣợc lại sẽ có hai vạch màu trong trƣờng hợp mẫu âm tính. Nguyên tắc hoạt động và đánh giá kết quả của phản ứng theo dạng cạnh tranh trong Hình 1.9.
Hình 1.9. Sắc ký miễn dịch cạnh tranh
Ƣu điểm của phƣơng pháp sắc ký miễn dịch cạnh tranh là đơn giản hóa quy trình phát triển que thử do chỉ cần sử dụng một kháng thể. Hiện nay, trên thị trƣờng chƣa có một cặp kháng thể thƣơng mại nào có thể bắt cặp với cả 5 loại độc tố tụ cầu (SEA, SEB, SEC, SED, SEE) nên nếu sử dụng phƣơng pháp miễn dịch cạnh tranh, chỉ cần sử dụng một kháng thể có khả năng liên kết đặc hiệu với 5 loại độc tố tụ cầu trên thì đã có thể phát triển đƣợc que thử sắc ký miễn dịch phát hiện 5 loại độc tố ruột tụ cầu phổ biến này. Trong luận án này, chúng tôi đã sử dụng ƣu điểm đó để tạo que thử phát hiện 5 loại độc tố ruột tụ cầu chỉ dựa trên một kháng thể IgY kháng (SEA, SEB, SEC, SED, SEE). Ngƣợc lại, nhƣợc điểm của sắc ký miễn dịch cạnh tranh là độ nhạy thấp hơn so với sử dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch kẹp đôi do sử dụng chỉ một kháng thể có khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên.
1.4.2. Một số nghiên cứu tạo que thử phát hiện độc tố ruột tụ cầu trong thực phẩm
Gần đây, một số nghiên cứu phát triển que thử ứng dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch để phát hiện các SE trong thực phẩm đã đƣợc công bố [20, 109].
41
Năm 2009, trong nghiên cứu của Boyle và các cộng sự đã sử dụng que thử dựa trên nguyên lý của kỹ thuật sắc ký miễn dịch kẹp đôi để phát hiện độc tố ruột SEB của tụ cầu trong sữa và các sản phẩm của sữa với nồng độ thấp nhất từ 0,25 ng/ml tới nồng độ cao nhất có thể phát hiện là 50 µg/ml, trong 20 phút [20]. Các thực phẩm đƣợc kiểm tra bao gồm sữa có 2% chất béo, sữa có hƣơng liệu và các sản phẩm có nguồn gốc từ sữa nhƣ sữa chua, sữa cho trẻ sơ sinh và kem. Các tác giả đã nhận thấy việc sử dụng que thử sắc ký miễn dịch để kiểm tra SEB trong các sản phẩm từ sữa đã giảm thiểu thời gian chuẩn bị mẫu. Các mẫu sữa (sữa 2% chất béo, sữa cho trẻ sơ sinh) có thể không cần pha loãng vì có khả năng chảy một cách dễ dàng vào que thử, còn các mẫu sữa và sản phẩm của sữa (sữa socola, kem, sữa chua) cần đƣợc pha loãng để có thể chảy đƣợc trên que thử. Điều thú vị là, mặc dù trong sữa chua có chất phụ gia là hoa quả, màu thực phẩm và có chứa chất béo nhƣng điều đó cũng không ảnh hƣởng đến sự phát hiện SEB. Trong các thử nghiệm phát hiện SEB này, màu trên que thử đã không bị nhạt đi khi để ở nhiệt độ phòng sau 30 phút. Báo cáo của Boyle cho thấy việc sử dụng thành công kỹ thuật sắc ký miễn dịch trong việc phát hiện nhanh sự có mặt của SEB trong sữa và sản phẩm của sữa [20].
Năm 2013, Keiko Yamada đã công bố nghiên cứu tạo que thử sắc ký miễn dịch phát hiện SEA trong sữa và sản phẩm của sữa dựa trên nguyên lý của kỹ thuật sắc ký miễn dịch kẹp đôi [109]. Trong nghiên cứu này, kháng thể gà IgY đa dòng kháng độc tố SEA tái tổ hợp đƣợc in lên vạch thử nghiệm của que thử sắc ký miễn dịch, kháng thể gà IgY đơn dòng kháng SEA tái tổ hợp đƣợc dùng làm kháng thể cộng hợp gắn keo vàng. Để chuẩn bị các mẫu mô phỏng độc tố trong thực phẩm, 102 CFU /ml chủng vi khuẩn S. aureus sinh độc tố SEA đƣợc nuôi cấy trong sữa với những khoảng thời gian khác nhau (0; 5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8 hoặc 9h) để sinh các lƣợng độc tố khác nhau tƣơng ứng, trộn dịch sữa chứa độc tố này vào các sản phẩm sữa (kem, sữa chua và cà phê sữa), sau đó thử nghiệm với que thử. Que thử đƣợc áp dụng thành công trong việc phát hiện trực tiếp SEA (0,2 ng/ml-50µg/ml) trong sữa, trong vòng 15 phút.
Gần đây, nhóm nghiên cứu tại Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội đã ứng dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch kẹp
42
đôi để tạo que thử phát hiện SEA trong sữa thanh trùng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các kháng thể thƣơng mại của hãng Abcam là kháng thể đa dòng thỏ kháng SEA làm kháng thể cộng hợp gắn hạt nano carbon, kháng thể đa dòng cừu kháng SEA để in lên vạch thử nghiệm, kháng thể cừu kháng kháng thể thỏ in lên vạch kiểm chứng , sau đó thử giới hạn phát hiện trong đệm và trong sữa của que thử . Kết quả là que thử có thể phát hiện nồng độ thấp nhất 1 ng/ml đối với SEA trong đệm, còn với sữa thanh trùng nhiễm chủ động SEA , nồng độ thấp nhất que thử xác đi ̣nh đƣợc là khoảng 3 ng/ml.
Năm 2012, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã ứng dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh để tạo que thử phát hiện nhanh độc tố ruột A của tụ cầu. Trong nghiên cứu này, độc tố ruột SEA tái tổ hợp đƣợc sản xuất và in lên vạch thử nghiệm của que thử, kháng thể đa dòng IgG thỏ kháng SEA đƣợc gắn với hạt nano carbon, sau khi tối ƣu hóa lƣợng SEA cần cố định và lƣợng kháng thể cộng hợp cần sử dụng, ngƣỡng phát hiện của que thử đƣợc xác định là khoảng 80ng/ml.