Nhằm thu đƣợc một lƣợng lớn SEC1 để tinh sạch, các điều kiện nuôi cấy thích hợp chủng E. coli BL21 mang vector pGS-21a-sec1 đã đƣợc ứng dụng để cảm ứng biểu hiện protein SEC1. Sau khi biểu hiện, các tế bào đƣợc phá vỡ bằng sóng siêu âm và tiến hành ly tâm 10.000g trong 15 phút để tách riêng pha cặn và pha dịch. Dịch nổi thu đƣợc dùng để phân tích protein tan và phần cặn đƣợc hòa với lƣợng nƣớc tƣơng ứng để kiểm tra protein không tan. Kiểm tra trên gel acrylamide cho thấy lƣợng protein SEC1 biểu hiện ở dạng hòa tan là đủ để tiến hành tinh sạch (Hình 3.11)
84
Hình 3. 11. Điện di đồ khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 tan của tế bào E. coli BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp ở 30oC
1: Protein tan tổng số; 2: Protein không tan tổng số ; 3: Protein tổng số mẫu đối chứng âm không cảm ứng IPTG; M: thang protein chuẩn
Để có thể sử dụng protein tái tổ hợp SEC1 phục vụ cho mục đích chẩn đoán, protein tái tổ hợp ở pha hòa tan phải đƣợc tinh sạch. Protein SEC1 tái tổ hợp có gắn với 6 histidin ở đầu N nên có thể đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp sắc ký ái lực với đuôi His, sử dụng Kit His Mag SepharoTMNi. Trong quá trình tinh chế, imidazol đƣợc sử dụng nhƣ chất cạnh tranh Ni2+ trong phức hợp Ni2+histidine. Một số protein của chủng chủ có mang histidine nên cũng có ái lực với Ni2+ trên cột. Tuy nhiên, lực liên kết của các protein này với Ni2+ yếu hơn nhiều so với của protein tái tổ hợp có đuôi His chứa 6-histidine liền kề nhau ở đầu N làm tăng ái lực với Ni2+ lên nhiều lần. Các protein có ái lực yếu hơn sẽ bị đẩy ra khỏi cột nhờ nồng độ imidazol trong đệm rửa. Các protein bám không đặc hiệu đƣợc loại bỏ bằng cách rửa nhiều lần với đệm rửa có nồng độ imidazol tăng dần. Để thu đƣợc độc tố SEC1 tái tổ hợp có độ tinh sạch cao, chúng tôi khảo sát nồng độ imidazol trong đệm rửa ở một số nồng độ (20; 30;40; 50; 60 mM) trong khoảng nồng độ imidazol đƣợc nhà sản xuất Kit khuyến cáo (20 ÷ 60 mM) với quy trình tinh sạch protein cho độ tinh sạch cao.
Hình 3.12. Điện di đồ protein SEC1 tinh sạch ở các nồng độ imidazol khác nhau
M: thang protein chuẩn, 6: mẫu protein trước khi tinh sạch, 1-5: các nồng độ imidazol trong đệm rửa lần lượt là: 60mM; 50mM; 40mM, 30mM và 20mM.
Kết quả khảo sát nồng độ imidazol của đệm rửa thể hiện ở Hình 3.11 cho thấy ở nồng độ imidazol là 20 mM (giếng 5) còn xuất hiện nhiều băng protein khác của vi
85
khuẩn E. coli xung quanh băng protein SEC1, ngƣợc lại từ nồng độ ≥ 30 mM imidazol (giếng 1-4) chỉ có một băng protein duy nhất, điều đó chứng tỏ rằng các protein lẫn trong dịch chiết protein tái tổ hợp tan đã đƣợc loại bỏ hiệu quả ở các nồng độ đệm rửa 30, 40, 50, 60 mM imidazol. Bên cạnh đó, kích thƣớc băng protein SEC1 tái tổ hợp đã đƣợc tinh sạch giảm dần từ giếng 4 đến giếng 1. Điều này chứng tỏ ở nồng độ imidazol đệm rửa là 30 mM, hầu hết các protein tạp nhiễm bị đẩy ra khỏi cột, trong khi đó SEC1
vẫn bám đặc hiệu. Tuy nhiên, khi nồng độ imidazol trong đệm rửa tiếp tục tăng lên từ 40 – 60 mM imidazol thì ngoài protein tạp nhiễm, một phần SEC1 cũng bị đẩy ra khỏi cột.
Nhƣ vâ ̣y, ở nồng độ imidazol trong đệm rửa là 30mM quá trình tinh sa ̣ch đã thu đƣợc protein SEC1 tái tổ hợp có hàm lƣợng protein và độ tinh sạch cao, không tạp nhiễm các protein của vi khuẩn, thể hiện bởi một băng protein đậm, rõ nét trên gel không có băng protein tạp nhiễm, có thể phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.