* Xác định giới hạn phát hiện của que thử nhanh
- Pha loãng các độc tố nguyên chất (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE) với nồng độ từ 1 đến 1000 ng/ml (1; 3; 10; 30; 100; 300; 1000 ng/ml). Mỗi mẫu phân tích đƣợc nhiễm chủ động một trong các nồng độ độc tố trên cho vào trong100 µl dung dịch đệm chạy (100 mM borat, pH 8,8; 0,5% Casein; 0,1% Tween 20) và đƣợc đƣa vào các đĩa vi giếng ELISA.
- Cắm que thử vào giếng và ủ trong 5 phút. Sau đó thêm 2 µl dung di ̣ch cô ̣ng hơ ̣p phát hiê ̣n vào giếng , đảo trô ̣n đều và que thƣ̉ đƣợc tiếp tục nhúng vào giếng và ủ trong 15 phút để toàn bộ lƣợng dung dịch trong giếng đƣợc hút cạn. Đọc kết quả.
- Nồng độ của độc tố SE thấp nhất cho kết quả dƣơng tính đƣợc xác định là giới hạn phát hiện của que thử.
71
Que thử đƣợc chia lô và bảo quản trong điều kiện khác nhau bao gồm: bảo quản ở nhiệt độ 25oC và ở 4oC, sau đó thử nghiệm khả năng phát hiện của que thử với độc tố chuẩn SE ở những khoảng thời gian 1 tháng lấy mẫu một lần để kiểm tra, trong 6 tháng.
2.3.3.3. Thử nghiệm que thử nhanh phát hiện độc tố ruột tụ cầu trên một số nhóm mẫu thực phẩm đã gây nhiễm độc tố SE
* Chuẩn bị mẫu
- Đối với mẫu sữa tƣơi tiê ̣t trùng: Pha loãng sữa tƣơi tiệt trùng trong đê ̣m cha ̣y (100 mM borat, pH 8,8; 0,5% Casein; 0,1% Tween 20; 0,02% NaN3), theo các tỷ lệ sữa: đệm chạy tƣơng ứng là: 1:0; 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; 1:6; 1:7; 1:8; 1:9. Sau đó lấy 100 µl dịch thu đƣơ ̣c cho vào giếng , sử dụng lƣợng kháng nguyên cộng hợp đã tối ƣu hóa để thử nghiệm. Mức độ pha loãng sữa thích hợp là mức độ pha loãng sữa thấp nhất mà tại đó vạch kiểm chứng và vạch thử nghiệm của que thử xuất hiện rõ nét.
- Đối với mẫu thịt : Tiến hành xay hoă ̣c nghiền mi ̣n sản phẩm thịt lợn trong cối sƣ́, sau đó cân 3 g sản phẩm trong mỗi ống Falcon 50 ml, gồm 8 ống. Bổ sung độc tố SEC1 với các nồng độ 30, 60, 90 và 120 ng/g lần lƣợt vào 4 ống, 4 ống không bổ sung độc tố.Thêm dung di ̣ch đê ̣m chạy (100 mM borat, pH 8,8; 0,5% Casein; 0,1% Tween 20; 0,02% NaN3) vào mỗi ống lần lƣợt theo các tỷ lê ̣ thịt: đệm chạy tƣơng ứng là 1: 2; 1: 4; 1: 6 và 1: 8 rồi tiến hành đảo trô ̣n đều . Tiến hành song song các kiểm chứng âm tính với các tỷ lệ trên. Tiếp đó, lọc dung dịch thu đ ƣợc bằng giấy lọc . Chuyển 100 µl dịch lọc vào giếng . Tiến hành phân tích các mẫu này bằng que thử. Tỷ lệ pha loãng thấp nhất của mẫu thịt mà tại đó vạch kiểm chứng và vạch thử nghiệm xuất hiện rõ nét sẽ đƣợc sử dụng cho các thử nghiệm đối với các que thử đƣợc chế tạo.
* Sử dụng que thử nhanh trên một số nhóm mẫu thực phẩm được gây nhiễm độc tố ruột tụ cầu với các nồng độ khác nhau
- Tiến hành nhiễm chủ động các nồng độ kháng nguyên SEA; SEB; SEC1; SED và SEE tinh khiết đã đƣợc pha loãng với các nồng độ 3000 ng/ml, 900 ng/ml, 300 ng/ml, 90 ng/ml, 30 ng/ml, 9 ng/ml và 3 ng/ml vào thực phẩm (mẫu sữa, mẫu thịt). Sau
72
đó làm thử nghiệm phát hiện độc tố ruột tụ cầu SE trong thực phẩm bằng que thử nhanh, mỗi mẫu đều đƣợc thử nghiệm lặp lại 3 lần.
Sơ đồ tổng hợp quá trình chế tạo que thử để phát hiện nhanh một số độc tố ruột tụ cầu trên thực phẩm đƣợc thể hiện ở Hình 2.6 dƣới đây:
Hình 2.6. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát quy trình chế tạo que thử
73
Số liệu thu thập đƣợc xử lý thống kê và xử lý bằng phần mềm MicroSoft Excel. Các chỉ số đƣa ra trong quá trình phân tích: tỷ lệ phần trăm, giá trị trung bình, độ lệch chuẩn p.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.1. SẢN XUẤT VÀ TINH CHẾ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU SEC1 TÁI TỔ HỢP
3.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ S. aureus
Hình ảnh điện di kiểm tra kích thƣớc DNA tổng số của chủng S. aureus P240 (Hình 3.1) cho thấy có 1 băng sáng rõ có kích thƣớc lớn ở trên cao, đó chính là DNA tổng số của S. aureus. Ngoài ra, bên dƣới xuất hiện một dải băng sáng mờ hơn DNA tổng số có thể là DNA plasmid, RNA có kích thƣớc nhỏ, những hợp phần này đã chạy nhanh hơn so với các DNA tổng số nên nằm ở phía dƣới. Nhƣ vậy, quy trình tách chiết đã thu đƣợc sản phẩm DNA đạt chất lƣợng để sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR khuếch đại gen sec1.
Hình 3.1. Điện di đồ DNA tổng số tách từ S. aureus
74
3.1.2. Khuếch đại gen sec1 bằng kỹ thuật PCR
Qua nghiên cứu bản đồ cắt hạn chế của gen sec1, sơ đồ cấu trúc của vector biểu hiện pGS-21a, chúng tôi nhận thấy hai điểm cắt của enzym giới hạn BamHI và HindIII (các enzym có trong trình tự đoạn polylinker của vector pGS-21a) không có trong trình tự gen sec1 của S. aureus. Do đó, trình tự điểm cắt của 2 enzym BamHI và HindIII
đƣợc bổ sung lần lƣợt vào đầu 5’ của cặp mồi xuôi và mồi ngƣợc tƣơng ứng. Trình tự mồi đƣợc thiết kế dựa trên trình tự gen sec1 với các thông số đƣợc thể hiện nhƣ sau: Mồi xuôi SEC-F (5'-TTTGGATCCGAGAGCCAACCAGACCCT-3') và mồi ngƣợc SEC-R (5'- TATAAGCTTTTATCCATTCTTTGTTGTAAGGTGGAC-3'), chữ đƣợc gạch chân là trình tự nhận biết của enzym giới hạn. Các đoạn mồi này đƣợc dùng trong phản ứng PCR để khuếch đại gen sec1từ DNA tổng số và phản ứng PCR sàng lọc những chủng đƣợc biến nạp thành công.
Từ cơ sở nguồn DNA tổng số tách từ S. aureus, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại gen sec1. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,2%, kết quả thể hiện ở Hình 3.2.
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agarose 1, 2%
M: thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2: đoạn gen sec1
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose (Hình 3.2) cho thấy với cặp mồi đặc hiệu SEC-F và SEC-R đã thu đƣợc sản phẩm PCR duy nhất, rõ nét, có kích thƣớc khoảng 800 bp, đúng với kích thƣớc lý thuyết khi thiết kế mồi (kích thƣớc của gen sec1 là 801 bp). Nhƣ vậy, đoạn DNA mang gen mã hóa protein SEC1 đã đƣợc khuyếch đại
75
đặc hiệu. Kết quả này chứng tỏ chƣơng trình và cặp mồi khuếch đại gen mã hóa cho protein SEC1 đã đƣợc thiết kế hợp lý về mặt lý thuyết và kỹ thuật. Sản phẩm PCR này đƣợc sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo.
3.1.3. Xây dựng vector biểu hiện pGS-21a mang gen sec1
* Cắt đoạn gen sec1 bằng các enzym giới hạn
Sản phẩm của phản ứng PCR sau khi tinh sạch đƣợc cắt bằng enzym giới hạn
BamHI và HindIII, kiểm tra sản phẩm cắt bằng điện di trên gel agarose 1.2%. Kết quả
kiểm tra sản phẩm tinh sạch đƣợc thể hiện trên điện di đồ (Hình 3.3) chỉ xuất hiện một băng duy nhất có kích thƣớc trong khoảng 800 bp, tƣơng đƣơng kích thƣớc của gen
sec1, không có sản phẩm phụ, đo đó có thể làm nguyên liệu sử dụng để tạo vector biểu
hiện.
Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm gen sec1 sau tinh sạch
M: thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2: đoạn gen sec1 sau tinh sạch * Cắt plasmid pGS-21a bằng enzym giới hạn
Chúng tôi tiến hành cắt mở vòng plasmid pGS-21a bằng hai enzym giới hạn
76
Hình 3.4. Điện di đồ plasmid pGS-21a sau khi cắt bằng enzyme cắt giới hạn
M: thang DNA chuẩn 1kb; 1: plasmid pGS-21a sau cắt chưa tinh sạch, 2: plasmid pGS-21a sau cắt đã tinh sạch.
Kết quả điện di ở Hình 3.4 cho thấy plasmid pGS-21a sau cắt đã tinh sạch đạt yêu cầu để sử dụng biến nạp, là một băng duy nhất có kích thƣớc gần tƣơng ứng với kích thƣớc của vector pGS-21a (6169 bp) nhƣ trong lý thuyết.
* Nối đoạn gen sec1 vào vector pGS-21a
Đoạn gen sec1 sau khi cắt bằng enzym giới hạn đƣợc nối vào vector pGS-21a bởi xúc tác của T4 DNA ligase. Sản phẩm ghép nối là plasmid pGS-21a - sec1 sẽ đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21.
Nhờ đặc tính của các enzyme cắt giới hạn có vị trí nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu nên chúng đƣợc sử dụng cho quá trình cắt và nối với gen sec1 và vector pGS-21a, tạo đầu dính phù hợp cho đoạn gen thu đƣợc sau khi tinh sạch sản phẩm của phản ứng PCR, tạo liên kết đầu dính phù hợp với vector biểu hiện pGS-21a. Tính bổ sung giữa những phần nhô ra (overhang) và các trình tự bổ sung cho phép gen sec1 có thể hòa nhập với vector thành vector tái tổ hợp một cách dễ dàng dƣới tác dụng của enzym T4 DNA ligase.
Plasmid pGS-21a đƣơ ̣c thiết kế để làm vectơ biểu hiê ̣n protein tá i tổ hợp trong
Escherichia coli, với promoter T7 đƣợc cảm ƣ́ng bởi IPTG để tổng hợp protein SEC1 có hiệu suất cao, có chứa gen kháng ampicilline làm gen chỉ thị, chọn lọc. Trên plasmid này có các trình tự mã hóa, cho phép ta ̣o ra độc tố SEC1 tái tổ hợp có dạng dung hợp đuôi GST- His dễ tách chiết và tinh sạch.
77
3.1.4. Kết quả biểu hiện gen mã hóa cho protein SEC1 tái tổ hợp
Biến nạp plasmid mang gen mã hóa SEC1 vào E. coli BL21
Plasmid pGS-21a-sec1 mang gen mã hóa độc tố ruột tụ cầu SEC1 đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Sau đó, chọn lọc khuẩn lạc biến nạp trên môi trƣờng LB có ampicillin. Trên môi trƣờng thạch LB, ứng với mẫu E. coli đã đƣợc biến nạp thấy xuất hiện khoảng 50 khuẩn lạc. Trong khi đó, ở mẫu E. coli chƣa đƣợc biến nạp, không thấy xuất hiện khuẩn lạc nào. Tất cả các khuẩn lạc trên là những khuẩn lạc đƣợc biến nạp chứa gen kháng ampicillin và số lƣợng khuẩn lạc thu đƣợc cũng đủ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Chọn lọc dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony - PCR
Phản ứng PCR khuếch đại gen mục tiêu sec1, với cặp mồi đặc hiệu SEC-F và
SEC-R đƣợc sử dụng để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen sec1 trong plasmid tái tổ hợp ở các dòng khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra, kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 3.5.
Hình 3.5 Điện di đồ sàng lọc khuẩn lạc mang pGS-21a-sec1 bằng colony PCR
M: thang DNA chuẩn 1kb; 1-5: sản phẩm PCR từ DNA của các mẫu khuẩn lạc thu được; (-): đối chứng âm.
Kết quả thu đƣợc trên Hình 3.5 cho thấy ở các giếng 1-5 đều xuất hiện 1 vạch sáng, rõ nét ở vị trí khoảng 800 tƣơng ứng với kích thƣớc của đoạn gen sec1 (801 bp). Nhƣ vậy, việc biến nạp plasmid tái tổ hợp pGS-21a-sec1vào trong tế bào E. coli BL21 đã
78
Kiểm tra đoạn gen biến nạp bằng giải trình tự gen
Do các đột biến có thể phát sinh trong quá trình thiết kế vector nên những khuẩn lạc đã xác định có đoạn gen sec1 đƣợc lựa chọn để tách chiết plasmid, các plasmid
mang gen sec1 đƣợc giải trình tự và đối chiếu với trình tự trên GeneBank của NCBI.
Những plasmid không mang bất cứ đột biến nào đƣợc lựa chọn để biểu hiện protein SEC1.
Hình 3.6. Hình ảnh giải trình tự gen của đoạn gen biến nạp sec1
Kết quả giải trình tự của đoạn gen sec1 (hình 3.6) cho thấy các đỉnh rõ nét và tƣơng đối đồng đều. So sánh với trình tự GeneBank có độ tƣơng đồng là 100%.
79
Gen sec1trong vector biểu hiện hoạt động dƣới sự điều khiển của T7 lac promoter và đƣợc kiểm soát chặt chẽ bởi chất cảm ứng IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) có trong môi trƣờng. Để nghiên cứu sự biểu hiện của protein tái tổ hợp, vi khuẩn sau khi biến nạp thành công đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh ampicillin, lắc với tốc độ 150 vòng/phút, ở 37oC cho đến khi OD600 đạt 0,6 thì bổ sung thêm chất cảm ứng IPTG với nồng độ 1mM và nuôi tiếp ở 30o C trong 5 giờ. Protein tổng số của dịch chiết tế bào đã đƣợc phân tích trên gel polacrylamide.
Hình 3.7. Điện di đồ so sánh protein tổng số của tế bào E. coli BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp
M: thang protein chuẩn; 1: Đối chứng âm (protein tan tổng số trong dịch chiết dòng khuẩn lạc E.coli BL21); 2: Protein tan trong dịch chiết của dòng khuẩn lạc E. coli BL21 mang pGS-
21a-sec1 được cảm ứng IPTG.
Kết quả kiểm tra protein tổng số của dòng tế bào mang pGS-21a-sec1 và dòng đối chứng đƣợc trình bày ở Hình 3.7 cho thấy sự xuất hiện của một băng protein với cƣờng độ đậm, có trọng lƣợng phân tử trong khoảng từ 42,7– 66,2 kDa khi so sánh với thang protein chuẩn, kết quả này phù hợp với protein mà chúng tôi mong đợi, cụ thể là: SEC1 trong trạng thái dung hợp với đuôi GST và 1 vùng đuôi His (6 axit amin Histidin) có khối lƣợng là 57 kDa (SEC1 có khối lƣợng khoảng 28 kDa, đuôi His – GST có khối lƣợng khoảng 29 kDa). Điều này chỉ ra rằng protein tái tổ hợp đƣợc tạo ra có kích thƣớc hoàn toàn phù hợp với các tính toán lý thuyết.
80
3.1.5. Xác định các điều kiện biểu hiện gen sec1 thích hợp trong E. coli
Để thu đƣợc lƣợng SEC1 nhiều và có hoạt tính sinh học cao, các điều kiện nuôi tế bào
E. coli chuyển gen nhƣ nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng và thời gian cảm ứng đƣợc tiến hành
khảo sát nhằm chọn điều kiện thích hợp cho biểu hiện protein SEC1 tái tổ hợp.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ là yếu tố có ảnh hƣởng hàng đầu đến sinh tổng hợp và chất lƣợng protein tái tổ hợp. Nhiệt độ càng cao thì lƣợng mARN càng dễ bị phá hủy và khả năng đào thải plasmid càng lớn. Trạng thái tồn tại của protein tái tổ hợp là một trong những điều kiện rất quan trọng cho việc ứng dụng. Thông thƣờng, các protein tồn tại ở dạng hòa tan sẽ giữ đƣợc hoạt tính sinh học và tính sinh miễn dịch cao do không bị biến đổi cấu trúc trong quá trình tinh chế và thu nhận protein. Ngƣợc lại, đối với nhiều loại protein khi đƣợc biểu hiện quá mạnh trong tế bào, thì các protein khác vốn giúp hình thành cấu trúc đúng của protein tái tổ hợp không đáp ứng đủ, dẫn đến hình thành cấu trúc bậc ba sai lệch, protein tạo ra không có hoạt tính sinh học. Theo lý thuyết, protein đƣợc biểu hiện dƣới dạng không tan thƣờng có cấu trúc sai lệch. Vì vậy cần phải lựa chọn đƣợc nhiệt độ thích hợp để thu nhận đƣợc tối đa lƣợng protein tái tổ hợp có hoạt tính sinh học.
Nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy E. coli BL 21 nhằm biểu hiện protein ngoại lai là từ 16oC đến 37oC, theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp protein SEC1 tái tổ hợp ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau là 30oC và 37oC với nồng độ chất cảm ứng 0,5 mM IPTG và thu mẫu sau 5 giờ. Lƣợng tế bào thu đƣợc sau khi ly tâm đƣợc chuẩn về cùng một OD600 là 10 để so sánh protein tổng số giữa các mẫu nuôi cấy cảm ứng ở các nhiệt độ khác nhau. Dịch chiết thu đƣợc sau khi phá tế bào đƣợc kiểm tra bằng điê ̣n di trên gel acrylamide 12,5%.
81
Hình 3.8. Điện di đồ so sánh khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 của tế bào E. coli BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp ở các nhiệt độ khác nhau
M: thang protein chuẩn; 1: Protein tan tổng số ở 37oC; 2: Protein tan tổng số ở 30oC.
Kết quả trên hình 3.8 cho thấy ở giếng số 2 xuất hiện băng protein SEC1 đậm hơn so với ở giếng số 1, điều đó chứng tỏ hàm lƣợng protein SEC1 dạng hòa tan trong điều kiện nhiệt độ 30oC nhiều hơn so với ở điều kiện 37oC. Vì vậy, nhiệt độ 30oC đƣợc lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.