* Cắt đoạn gen sec1 bằng các enzym giới hạn
Sản phẩm của phản ứng PCR sau khi tinh sạch đƣợc cắt bằng enzym giới hạn
BamHI và HindIII, kiểm tra sản phẩm cắt bằng điện di trên gel agarose 1.2%. Kết quả
kiểm tra sản phẩm tinh sạch đƣợc thể hiện trên điện di đồ (Hình 3.3) chỉ xuất hiện một băng duy nhất có kích thƣớc trong khoảng 800 bp, tƣơng đƣơng kích thƣớc của gen
sec1, không có sản phẩm phụ, đo đó có thể làm nguyên liệu sử dụng để tạo vector biểu
hiện.
Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm gen sec1 sau tinh sạch
M: thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2: đoạn gen sec1 sau tinh sạch * Cắt plasmid pGS-21a bằng enzym giới hạn
Chúng tôi tiến hành cắt mở vòng plasmid pGS-21a bằng hai enzym giới hạn
76
Hình 3.4. Điện di đồ plasmid pGS-21a sau khi cắt bằng enzyme cắt giới hạn
M: thang DNA chuẩn 1kb; 1: plasmid pGS-21a sau cắt chưa tinh sạch, 2: plasmid pGS-21a sau cắt đã tinh sạch.
Kết quả điện di ở Hình 3.4 cho thấy plasmid pGS-21a sau cắt đã tinh sạch đạt yêu cầu để sử dụng biến nạp, là một băng duy nhất có kích thƣớc gần tƣơng ứng với kích thƣớc của vector pGS-21a (6169 bp) nhƣ trong lý thuyết.
* Nối đoạn gen sec1 vào vector pGS-21a
Đoạn gen sec1 sau khi cắt bằng enzym giới hạn đƣợc nối vào vector pGS-21a bởi xúc tác của T4 DNA ligase. Sản phẩm ghép nối là plasmid pGS-21a - sec1 sẽ đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21.
Nhờ đặc tính của các enzyme cắt giới hạn có vị trí nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu nên chúng đƣợc sử dụng cho quá trình cắt và nối với gen sec1 và vector pGS-21a, tạo đầu dính phù hợp cho đoạn gen thu đƣợc sau khi tinh sạch sản phẩm của phản ứng PCR, tạo liên kết đầu dính phù hợp với vector biểu hiện pGS-21a. Tính bổ sung giữa những phần nhô ra (overhang) và các trình tự bổ sung cho phép gen sec1 có thể hòa nhập với vector thành vector tái tổ hợp một cách dễ dàng dƣới tác dụng của enzym T4 DNA ligase.
Plasmid pGS-21a đƣơ ̣c thiết kế để làm vectơ biểu hiê ̣n protein tá i tổ hợp trong
Escherichia coli, với promoter T7 đƣợc cảm ƣ́ng bởi IPTG để tổng hợp protein SEC1 có hiệu suất cao, có chứa gen kháng ampicilline làm gen chỉ thị, chọn lọc. Trên plasmid này có các trình tự mã hóa, cho phép ta ̣o ra độc tố SEC1 tái tổ hợp có dạng dung hợp đuôi GST- His dễ tách chiết và tinh sạch.
77