Biến nạp plasmid mang gen mã hóa SEC1 vào E. coli BL21
Plasmid pGS-21a-sec1 mang gen mã hóa độc tố ruột tụ cầu SEC1 đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Sau đó, chọn lọc khuẩn lạc biến nạp trên môi trƣờng LB có ampicillin. Trên môi trƣờng thạch LB, ứng với mẫu E. coli đã đƣợc biến nạp thấy xuất hiện khoảng 50 khuẩn lạc. Trong khi đó, ở mẫu E. coli chƣa đƣợc biến nạp, không thấy xuất hiện khuẩn lạc nào. Tất cả các khuẩn lạc trên là những khuẩn lạc đƣợc biến nạp chứa gen kháng ampicillin và số lƣợng khuẩn lạc thu đƣợc cũng đủ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Chọn lọc dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony - PCR
Phản ứng PCR khuếch đại gen mục tiêu sec1, với cặp mồi đặc hiệu SEC-F và
SEC-R đƣợc sử dụng để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen sec1 trong plasmid tái tổ hợp ở các dòng khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra, kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 3.5.
Hình 3.5 Điện di đồ sàng lọc khuẩn lạc mang pGS-21a-sec1 bằng colony PCR
M: thang DNA chuẩn 1kb; 1-5: sản phẩm PCR từ DNA của các mẫu khuẩn lạc thu được; (-): đối chứng âm.
Kết quả thu đƣợc trên Hình 3.5 cho thấy ở các giếng 1-5 đều xuất hiện 1 vạch sáng, rõ nét ở vị trí khoảng 800 tƣơng ứng với kích thƣớc của đoạn gen sec1 (801 bp). Nhƣ vậy, việc biến nạp plasmid tái tổ hợp pGS-21a-sec1vào trong tế bào E. coli BL21 đã
78
Kiểm tra đoạn gen biến nạp bằng giải trình tự gen
Do các đột biến có thể phát sinh trong quá trình thiết kế vector nên những khuẩn lạc đã xác định có đoạn gen sec1 đƣợc lựa chọn để tách chiết plasmid, các plasmid
mang gen sec1 đƣợc giải trình tự và đối chiếu với trình tự trên GeneBank của NCBI.
Những plasmid không mang bất cứ đột biến nào đƣợc lựa chọn để biểu hiện protein SEC1.
Hình 3.6. Hình ảnh giải trình tự gen của đoạn gen biến nạp sec1
Kết quả giải trình tự của đoạn gen sec1 (hình 3.6) cho thấy các đỉnh rõ nét và tƣơng đối đồng đều. So sánh với trình tự GeneBank có độ tƣơng đồng là 100%.
79
Gen sec1trong vector biểu hiện hoạt động dƣới sự điều khiển của T7 lac promoter và đƣợc kiểm soát chặt chẽ bởi chất cảm ứng IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) có trong môi trƣờng. Để nghiên cứu sự biểu hiện của protein tái tổ hợp, vi khuẩn sau khi biến nạp thành công đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh ampicillin, lắc với tốc độ 150 vòng/phút, ở 37oC cho đến khi OD600 đạt 0,6 thì bổ sung thêm chất cảm ứng IPTG với nồng độ 1mM và nuôi tiếp ở 30o C trong 5 giờ. Protein tổng số của dịch chiết tế bào đã đƣợc phân tích trên gel polacrylamide.
Hình 3.7. Điện di đồ so sánh protein tổng số của tế bào E. coli BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp
M: thang protein chuẩn; 1: Đối chứng âm (protein tan tổng số trong dịch chiết dòng khuẩn lạc E.coli BL21); 2: Protein tan trong dịch chiết của dòng khuẩn lạc E. coli BL21 mang pGS-
21a-sec1 được cảm ứng IPTG.
Kết quả kiểm tra protein tổng số của dòng tế bào mang pGS-21a-sec1 và dòng đối chứng đƣợc trình bày ở Hình 3.7 cho thấy sự xuất hiện của một băng protein với cƣờng độ đậm, có trọng lƣợng phân tử trong khoảng từ 42,7– 66,2 kDa khi so sánh với thang protein chuẩn, kết quả này phù hợp với protein mà chúng tôi mong đợi, cụ thể là: SEC1 trong trạng thái dung hợp với đuôi GST và 1 vùng đuôi His (6 axit amin Histidin) có khối lƣợng là 57 kDa (SEC1 có khối lƣợng khoảng 28 kDa, đuôi His – GST có khối lƣợng khoảng 29 kDa). Điều này chỉ ra rằng protein tái tổ hợp đƣợc tạo ra có kích thƣớc hoàn toàn phù hợp với các tính toán lý thuyết.
80