Hệ thống sắc ký miễn dịch (HTSKMD) thƣờng có cấu trúc gồm các hợp phần đƣợc biểu diễn trong Hình 1.7 dƣới đây [88]:
Hình 1.7. Các hợp phần trong hệ thống sắc ký miễn dịch
HTSKMD thiết kế theo kiểu truyền thống bao gồm một số vùng, thƣờng đƣợc cấu thành bởi các phân đoạn làm từ các vật liệu khác nhau, gồm có: Điểm tra mẫu (sample pad), miếng giữ kháng thể cộng hợp (conjugate), màng nitrocellulose, giấy thấm (absorbent pad) và tấm lót plastic (Plastic adhesive backing card). Hệ thống này đƣợc tạo thành với các thành phần gối lên nhau: điểm tra mẫu đƣợc xếp gối lên miếng giữ kháng thể cộng hợp, rồi miếng này đƣợc xếp chồng dính với màng nitrocellulose, các hợp phần đó đƣợc đặt trên một tấm lót có chứa keo để gắn các hợp phần, chất keo này nhạy cảm với áp suất.
Điểm tra mẫu (Sample pad)
Điểm tra mẫu có chức năng là đƣa chất cần phân tích vào hệ thống và lọc mẫu, loại bỏ các chất không tan, chỉ cho các chất hòa tan trong mẫu đi qua và thẩm thấu lên màng chứa chất cộng hợp màu. Ngoài ra, điểm tra mẫu ở một số que thử còn chứa các chất nhƣ đệm ổn định mẫu, các chất hoạt động bề mặt, loại các muối, các chất có khả năng phong bế nhằm hạn chế sự tƣơng tác không đặc hiệu của điểm tra mẫu hoặc của chất cộng hợp màu với chất cần phân tích. Vật liệu làm miếng tra mẫu thƣờng là cellulose, sợi thủy tinh hoặc polyetylen[88].
35
Miếng giữ kháng thể cộng hợp là nơi chứa chất chỉ thị để nhận biết kết quả của phản ứng, thƣờng là kháng thể đơn dòng, cộng hợp vàng, cộng hợp nanocarbon,...và bảo quản, giải phóng kháng thể cộng hợp có màu khi thực hiện phép phân tích mẫu một cách có hiệu quả. Khi dòng dung dịch mẫu chảy qua, toàn bộ chất trong mẫu và cộng hợp màu đều bị rửa trôi hoàn toàn trên màng nitrocellulose. Màng có tính trơ với các hóa chất và không có khả năng liên kết protein. Màng chứa chất cộng hợp thƣờng làm từ vật liệu là màng sợi thủy tinh hoặc polystyren không thấm nƣớc.
Giấy thấm
Giấy thấm có chức năng hút chất lỏng ra khỏi màng nitrocellulose, tạo dòng thẩm thấu một chiều, không cho dòng quay ngƣợc trở lại, dung dịch đi từ điểm tra mẫu dọc theo chiều dài que thử đi lên phía giấy thấm, với tốc độ dòng thích hợp. Dòng thẩm thấu chạy trong que thử chỉ dừng lại khi giấy thấm đã hút đầy dung dịch mẫu. Vật liệu dùng làm giấy thấm thƣờng là cellulose, polyester, các loại len,.... [76, 88].
Tấm lót plastic
Tấm lót plastic có tác dụng nhƣ một giá đỡ để dán các hợp phần lên trên, hình thành một tấm hoàn chỉnh có thể cắt thành que thử. Nhiệm vụ của tấm lót plastic là để tăng tính bền, dễ thao tác đồng thời đảm bảo sự tiếp xúc chính xác giữa các hợp phần trong HTSKMD nhằm tạo ra dòng chuyển động thích hợp dƣới tác dụng của lực mao dẫn. Bề mặt tấm lót plastic đƣợc phủ một lớp keo rất đặc biệt, mỏng và đều. Vật liệu chế tạo tấm lót phải là các vật liệu trơ về mặt hóa học với các hóa chất sử dụng trong que thử, có bản chất là cellulose cứng [88].
Màng nitrocellulose
Màng nitrocellulose là nơi gắn các kháng thể cố định để tạo thành vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng và có chức năng dẫn mẫu, các kháng thể, kháng nguyên di động chạy trên bề mặt của màng. Việc lựa chọn loại màng nitrocellulose cũng có ý nghĩa quan trọng đến độ nhạy và độ đặc hiệu của phép phân tích. Màng nitrocellulose liên kết với các protein bằng lực hút tĩnh điện giữa ester nitrat với các liên kết peptid trong phân tử protein. Khả năng liên kết của màng nitrocellulose đƣợc quyết định bởi diện tích bề mặt tiếp xúc của màng. Chỉ số này lại phụ thuộc vào các yếu tố nhƣ kích
36
thƣớc lỗ, mật độ lỗ, độ dày màng, đặc tính vật lý của màng. Do màng nitrocellulose có ái lực lớn với protein nên trong một số trƣờng hợp phải phong bế màng (blocking trên màng ) để giảm thiểu các liên kết không đặc hiệu của mẫu phân tích và kháng thể cộng hợp đối với vạch thử nghiệm cũng nhƣ để giảm thiểu tín hiệu nền trên màng. Quá trình phong bế thƣờng đƣợc thực hiện bằng cách nhúng màng nitrocellulose vào các dung dịch protein hay các chất có hoạt tính bề mặt nhƣ: các loại protein (casein, gelatin, BSA,...) và đƣờng cao phân tử [88].
Các thành phần tham gia
Có 3 loại kháng thể thƣờng đƣợc sử dụng trong sắc ký miễn dịch:
- Kháng thể phát hiện hay kháng thể cộng hợp (conjugate antibody): là kháng thể kháng lại với một epitop của kháng nguyên cần phân tích; kháng thể phát hiện thƣờng đƣợc gắn với các hạt nano vàng, nano carbon hay hạt cao su có màu. Hiện nay, hạt vàng (colloidal gold particle) có màu đỏ hay đƣợc sử dụng nhất trong các hệ thống sắc ký miễn dịch [88]. Tuy nhiên, giá thành của hạt vàng hiện vẫn rất cao. Một giải pháp là có thể sử dụng hạt nano carbon để tạo kháng thể cộng hợp. Ƣu điểm chính của hạt nano carbon là có giá thành thấp, có màu đen, do vậy tạo tín hiệu có tính tƣơng phản cao với màng nitrocellulose giúp làm tăng độ nhạy của phép phân tích.
- Kháng thể vạch thử nghiệm (test line antibody hay capture line antibody): là kháng thể kháng lại một epitop khác của cùng kháng nguyên cần phân tích, đƣợc cố định lên màng nitrocellulose. Độ nhạy của que thử và độ nét của vạch thử nghiệm phụ thuộc nhiều vào nồng độ, khả năng bắt giữ của kháng thể vạch thử nghiệm. Trong trƣờng hợp kháng thể vạch thử nghiệm liên kết với màng không tốt hoặc các liên kết không đặc hiệu trên màng không đƣợc phong bế thì vạch thử nghiệm sẽ không nét, bị phân tán.
- Kháng thể vạch kiểm chứng (control line antibody): là kháng thể kháng lại kháng thể cộng hợp, có nguồn gốc khác loài với kháng thể cộng hợp. Vạch kiểm chứng cho biết hoạt động của que thử bình thƣờng. Nếu không xuất hiện vạch kiểm chứng thì điều đó chứng tỏ que thử đã lỗi, kết quả không chính xác, cần phải tiến hành
37
lại thí nghiệm với một que thử khác, pha loãng mẫu phân tích hoặc kiểm tra lại quy trình chuẩn bị mẫu.