Plasmid pGS-21a-sec1, mang gen mã hóa SEC1 dạng dung hợp với đuôi His- GST, đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 (New England Biolabs) bằng
phƣơng pháp sốc nhiệt theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất nhƣ sau: Rã đông một ống tế bào khả biến E. coli BL21 trong đá trong 10 phút. Thêm 2µl plasmid pGS-21a (20ng DNA plasmid) vào ống chứa tế bào khả biến, trộn đều và ủ trong đá 30 phút. Sốc nhiệt ở 42oC trong 10 giây, ủ đá trong 5 phút. Thêm 950µl môi trƣờng SOC vào ống và ủ ở 37oC trong 60 phút, lắc 150 vòng/phút. Cấy trải 50, 100, 200 µl lên bề mặt thạch LB có bổ sung 100mg/l ampicillin và ủ qua đêm ở 37oC. Kiểm tra kết quả biến nạp bằng kỹ thuật PCR.
- Kiểm tra đoạn gen biến nạp + Kỹ thuật PCR colony
Để kiểm tra về sự có mặt của đoạn gen sec1 trong plasmid của tế bào biểu hiện protein E. coli BL21, từ kết quả cấy trải các tế bào đã biến nạp trên môi trƣờng thạch LB có bổ sung ampicillin, chọn 5 khuẩn lạc đặc trƣng để nuôi tăng sinh trong môi trƣờng LB lỏng có ampicillin, mỗi chủng nuôi trong 3ml môi trƣờng qua đêm ở 30oC, lắc 150 vòng/phút. Các dòng vi khuẩn đƣợc sàng lọc bằng kỹ thuật PCR khuếch đại gen mục tiêu sec1 với cặp mồi đặc hiệu SEC-F và SEC-R đƣợc thực hiện nhƣ ở mục 2.3.1.2 để tìm khuẩn lạc mang vector pGS-21a-sec1.
60
Các khuẩn lạc mang plasmid pGS-21a-sec1 đã đƣợc sàng lọc bằng phản ứng PCR đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung ampicillin. Sau đó, DNA của những plasmid tái tổ hợp đƣợc tách chiết và tinh sạch theo Kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System với quy trình của nhà cung cấp. Plasmid tái tổ hợp đƣợc cắt bằng các enzyme giới hạn là BamHI và HindIII. Thành phần phản ứng
cắt với enzym giới hạn có thể tích 50 µl nhƣ sau: 5 µl dung dịch đệm, 2 µl BamHI, 2 µl HindIII, 35 µl DNA, 6 µl nƣớc khử ion vô trùng. Phản ứng đƣợc ủ ở 37oC trong 30 phút, sau đó ủ ở 80oC trong 10 phút để bất hoạt enzym. Sản phẩm cắt (gen sec1) đƣợc tinh sa ̣ch và ki ểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%. DNA của plasmid đƣợc chuẩn bị với cặp mồi T7 promoter + T7 terminator và đem gửi công ty VnDat Co. Ltd để giải trình tự ở công ty 1st Base Selangor, Malaysia.