Để thu đƣợc lƣợng SEC1 nhiều và có hoạt tính sinh học cao, các điều kiện nuôi tế bào
E. coli chuyển gen nhƣ nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng và thời gian cảm ứng đƣợc tiến hành
khảo sát nhằm chọn điều kiện thích hợp cho biểu hiện protein SEC1 tái tổ hợp.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ là yếu tố có ảnh hƣởng hàng đầu đến sinh tổng hợp và chất lƣợng protein tái tổ hợp. Nhiệt độ càng cao thì lƣợng mARN càng dễ bị phá hủy và khả năng đào thải plasmid càng lớn. Trạng thái tồn tại của protein tái tổ hợp là một trong những điều kiện rất quan trọng cho việc ứng dụng. Thông thƣờng, các protein tồn tại ở dạng hòa tan sẽ giữ đƣợc hoạt tính sinh học và tính sinh miễn dịch cao do không bị biến đổi cấu trúc trong quá trình tinh chế và thu nhận protein. Ngƣợc lại, đối với nhiều loại protein khi đƣợc biểu hiện quá mạnh trong tế bào, thì các protein khác vốn giúp hình thành cấu trúc đúng của protein tái tổ hợp không đáp ứng đủ, dẫn đến hình thành cấu trúc bậc ba sai lệch, protein tạo ra không có hoạt tính sinh học. Theo lý thuyết, protein đƣợc biểu hiện dƣới dạng không tan thƣờng có cấu trúc sai lệch. Vì vậy cần phải lựa chọn đƣợc nhiệt độ thích hợp để thu nhận đƣợc tối đa lƣợng protein tái tổ hợp có hoạt tính sinh học.
Nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy E. coli BL 21 nhằm biểu hiện protein ngoại lai là từ 16oC đến 37oC, theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp protein SEC1 tái tổ hợp ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau là 30oC và 37oC với nồng độ chất cảm ứng 0,5 mM IPTG và thu mẫu sau 5 giờ. Lƣợng tế bào thu đƣợc sau khi ly tâm đƣợc chuẩn về cùng một OD600 là 10 để so sánh protein tổng số giữa các mẫu nuôi cấy cảm ứng ở các nhiệt độ khác nhau. Dịch chiết thu đƣợc sau khi phá tế bào đƣợc kiểm tra bằng điê ̣n di trên gel acrylamide 12,5%.
81
Hình 3.8. Điện di đồ so sánh khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 của tế bào E. coli BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp ở các nhiệt độ khác nhau
M: thang protein chuẩn; 1: Protein tan tổng số ở 37oC; 2: Protein tan tổng số ở 30oC.
Kết quả trên hình 3.8 cho thấy ở giếng số 2 xuất hiện băng protein SEC1 đậm hơn so với ở giếng số 1, điều đó chứng tỏ hàm lƣợng protein SEC1 dạng hòa tan trong điều kiện nhiệt độ 30oC nhiều hơn so với ở điều kiện 37oC. Vì vậy, nhiệt độ 30oC đƣợc lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG
Chất cảm ứng IPTG đƣợc sử dụng nhƣ một yếu tố trung hòa chất ức chế. Tuy nhiên, IPTG ở nồng độ cao có thể gây độc cho tế bào và ức chế tế bào sinh trƣởng. Vì vậy, khi thêm IPTG vào quá trình nuôi cấy chỉ nên cho lƣợng vừa đủ để trung hòa chất ức chế mà không gây ảnh hƣởng cho sự sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng của tế bào. Bên cạnh đó, do IPTG có giá thành cao nên việc xác định nồng độ IPTG thích hợp nhất cho nghiên cứu cũng có giá trị thiết thực khi áp dụng sản xuất độc tố ở quy mô lớn.
Hình 3.9. Điện di đồ so sánh khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 của tế bào E. coli BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp ở các điều kiện IPTG khác nhau
1-7: Protein tan tổng số trong dịch chiết của dòng khuẩn lạc E. coli BL21 mang pGS-21a- sec1 được cảm ứng ở các nồng độ IPTG lần lượt là 1mM; 0,9 mM; 0,7mM; 0,5mM; 0,3mM; 0,1mM; 0,05mM, 8: chứng âm (protein tan tổng số trong dịch chiết dòng khuẩn lạc E. coli BL21 không bổ sung IPTG), 9: thang protein chuẩn.
82
Kết quả kiểm tra lƣợng protein tái tổ hợp đƣợc tổng hợp khi chủng E. coli
mang gen sec1 đƣợc cảm ứng ở 0,05 - 1mM IPTG (Hình 3.9) cho thấy sản lƣợng protein SEC1 không bị ảnh hƣởng nhiều bởi các nồng độ chất cảm ứng đã đƣợc thí nghiệm, ít có sự sai khác về sản lƣợng protein tái tổ hợp. Tuy nhiên, tại các nồng độ khác nhau của chất cảm ứng thì sự biểu hiện của nồng độ protein vẫn có sự khác nhau: ở nồng độ chất cảm ứng IPTG là 0,5 mM đến 1mM thì nồng độ protein biểu hiện là cao hơn so với 3 nồng độ 0,05 mM; 0,1 mM và 0,3 mM. Vì thế để thu đƣợc sản lƣợng protein tái tổ hợp cao nhất mà vẫn tiết kiệm đƣợc lƣợng IPTG cần sử dụng, chúng tôi chọn nồng độ chất cảm ứng IPTG cho chủng mang gen sec1 là 0,5 mM (giếng 4).
Xác định thời điểm thích hợp để thu sản phẩm biểu hiện
Protein tái tổ hợp bắt đầu đƣợc tổng hợp từ pha log ngay sau khi bổ sung IPTG vào môi trƣờng. Trong quá trình nuôi cấy, khi tế bào sinh trƣởng tới một mức sinh khối nhất định ở pha cân bằng, là khoảng thời gian mà nguồn dinh dƣỡng bị cạn dần, nên tế bào có khuynh hƣớng tiết nhiều protease để phân hủy tế bào chết và chuyển hóa các sản phẩm phụ thành nguồn dinh dƣỡng để duy trì tế bào. Nếu thu tế bào quá muộn, nhiều tế bào già bị chết nên hàm lƣợng protein tái tổ hợp cũng giảm đi, lƣợng protein tái tổ hợp chỉ đạt tối đa ở một thời điểm nhất định. Do đó, cần phải xác định thời điểm thích hợp để thu nhận hàm lƣợng protein SEC1 tái tổ hợp.
Hình 3.10. Điện di đồ so sánh khả năng sinh tổng hợp protein SEC1 của tế bào E. coli BL21 mang gen sec1 tái tổ hợp sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau
83
M: thang protein chuẩn, 1-4: Protein tan tổng số trong dịch chiết của dòng khuẩn lạc E. coli BL21 mang pGS-21a-sec1 được nuôi cấy ở các điều kiện thời gian lần lượt là: 8h; 5h; 2h; 0h
Trong thí nghiệm này, chủng tái tổ hợp mang gen sec1 đƣợc cảm ứng với 0,5mM IPTG và nuôi cấy ở 30oC để sinh tổng hợp protein tái tổ hợp. Tế bào đƣợc thu ở các thời điểm khác nhau: 0, 2, 5, 8 giờ để kiểm tra lƣợng SEC1 pha tan trên gel polyacrylamide nhằm xác định thời gian thích hợp cho việc thu nhận protein tái tổ hợp. Kết quả (Hình 3.10) cho thấy lƣợng protein tái tổ hợp SEC1 đƣợc tổng hợp lớn nhất sau 8 giờ cảm ứng.
Nhƣ vậy, điều kiện thích hợp để cảm ứng biểu hiện protein SEC1 trong chủng biểu hiện E. coli BL21 là ở nhiệt độ 30oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,5 mM và thu protein sau 8 giờ cảm ứng.