Các điều kiện nuôi cấy S. aureus nhằm kích thích tạo các SE đã đƣợc làm sáng tỏ. Tuy nhiên, việc tinh sạch các SE thƣờng rất phức tạp, gồm nhiều công đoạn do phải loại bỏ hoàn toàn protein A vốn có khả năng liên kết với các dạng IgG. Sản xuất các SE theo con đƣờng tái tổ hợp giúp khắc phục các nhƣợc điểm đã nêu ở trên. Trong trƣờng hợp một hỗn hợp của các protein chƣa biết hoặc một chiết xuất tế bào đã biết, có nhiều cách khác nhau để chọn các bƣớc tinh sạch tối thiểu và hiệu quả nhất nhằm đạt đƣợc độ tinh sạch mong muốn (ví dụ 98%, 99,5% hoặc 99,9%) [15]. Để protein tái tổ hợp đạt đƣợc độ tinh sạch cao dùng cho phân tích hoặc điều trị, một số kỹ thuật sắc
51
ký có thể đƣợc sử dụng: sắc ký trao đổi ion, sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc, lọc gel và sắc ký ái lực [108].
Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam đã sản xuất các SE, gồm: SEA, SEB, SEC, SED, SEE tái tổ hợp [4, 6, 61, 72, 109]. Khi sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp, có thể sản xuất SE trong tế bào khả biến Escherichia coli không sinh protein A. Đồng thời, khi sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp, chúng ta có thể tạo ra các SE dƣới dạng dung hợp với các đuôi ái lực, độc tố tái tổ hợp sẽ nối thêm 6 acid amin Histidin (đuôi His); hoặc nối thêm glutathione-S-transferase (đuôi GST). Các kỹ thuật DNA tái tổ hợp này sẽ cho phép đơn giản hóa quy trình tinh sạch đi rất nhiều. Ví dụ, đuôi His có ái lực cao với Ni2+ do có vòng thơm imidazole, vì thế protein dung hợp với đuôi His đƣợc giữ lại trên cột sắc ký chứa các hạt resin có gắn Ni2+, còn những protein không mong muốn sẽ ra khỏi cột này. Nhƣ vậy, sắc ký ái lực có thể cho phép thu protein đích bằng một bƣớc duy nhất, với độ tinh sạch cao.
Năm 2012, Liben Chen và các cộng sự đã tách dòng gen sea từ S. aureus, thiết
kế thành công vec tơ biểu hiện pGEX-sea và biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli
BL21. SEA tái tổ hợp ở dạng dung hợp với đuôi GST có khối lƣợng phân tử khoảng 56 kDa đƣợc tinh sạch bằng sắc ký ái lực có độ tinh sạch cao, để sản xuất vaccin chống SE [61].
Năm 2013, Wangchun Jin và các cộng sự đã sản xuất đƣợc các SEA, SEB, SEC, SED và SEE tái tổ hợp với đuôi His để làm các kháng nguyên cho sản xuất kháng thể IgY ở gà. Nghiên cứu này sử dụng vector pQE30 và chủng E. coli XL1-
Blue để biểu hiện các gen SE, các SE tái tổ hợp trên đƣợc tinh sạch bằng sắc ký ái lực với cột gắn Ni2+ [109].
Đầu năm 2014, Nandita P. Agnihotri đã công bố sản xuất SEC2 tái tổ hợp với đuôi His sử dụng vector biểu hiện pQE30Xa và biểu hiện trong tế bào vi khuẩn E. coli SG13009, tạo ra protein tƣơng ứng với khối lƣợng khoảng 29,7 kDa [72]. Protein tái tổ hợp đƣợc tinh sạch bằng sắc ký ái lực với cột gắn Ni2+ và đƣợc sử dụng để tạo kháng thể trên thỏ.
52
Trong nghiên cứu của Nghiêm Ngọc Minh (2011) đã tiến hành tách dòng gen
seb từ S. aureus bằng vector tách dòng pJet, thiết kế thành công vector biểu hiện
pET21a+ mang gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp SEB dạng tự nhiên có độc tính và biểu hiện trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21. Protein tái tổ hợp SEB có đuôi His, khối lƣợng 28 kDa đƣợc tinh sạch thành công bằng cột Nikel Resin sẽ phục vụ làm nguyên liệu tạo SEB tái tổ hợp ở dạng đột biến không có độc tính, làm nguyên liệu cho việc tạo Kit phát hiện nhanh NĐTP do SE [6].
Năm 2012, nhóm nghiên cứu của chúng tôi cũng đã sản xuất thành công độc tố SEA tái tổ hợp để làm nguyên liệu tạo que thử SEA bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh . Protein SEA tái tổ hợp đã đƣợc tạo ra ở trạng thái dung hợp với glutathione-S-transferase (GST) có khối lƣợng khoảng 53 kDa nhờ biểu hiện trong tế bào E. coli BL21 mang plasmid pGEX-6P-1-sea và đƣơ ̣c tinh sạch bằng sắc ký ái lƣ̣c sƣ̉ du ̣ng bộ kit GST SpinTrap [4].
53
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid
- Chủng Staphylococcus aureus P240 mang gen độc tố sec1 phân lập từ sữa, đƣợc cung cấp bởi phòng Vi sinh, Viện Dinh dƣỡng Quốc gia, chủng đƣợc tham chiếu thƣờng xuyên với chủng chuẩn S.aureus ATCC29213.
- Tế bào vi khuẩn khả biến Escherichia coli chủng BL21 (SHuffle® T7 Express Competent E. coli, C3030) (New England Biolab, Mỹ) sử dụng cho mục đích biểu
hiện protein SEC1.
- Vector biểu hiện pGS-21a có kích thƣớc 6169 bp [T7-P, GST-tag, His-tag, Amp] (Genescript, Mỹ).
Hình 2.1. Sơ đồ vector biểu hiện pGS-21a
- Các độc tố ruột của tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED và SEE chuẩn của hãng Toxin Technology, Mỹ.
54
2.1.2. Động vật thí nghiệm
Gà mái dòng thuần Leghorn trắng, 1 ngày tuổi, gồm 30 con, cân nặng 35- 40g/con, mua từ Công ty cổ phần giống gia cầm Ba Vì, nuôi tại Hải Dƣơng.
2.1.3. Thực phẩm thử nghiệm
Một số mẫu thực phẩm thu thập tại địa bàn Hà Nội bao gồm:
- Sữa tƣơi tiệt trùng không đƣờng, thành phần dinh dƣỡng trong 100ml gồm chất đạm: 2,9 g; chất béo: 3,3 g; hydratcarbon: 4,7g, hỗn hợp các vitamin và khoáng chất. Mẫu thu thập ngày 15 tháng 8 năm 2014, 1 lốc gồm 4 hộp.
- Thịt lợn: Mẫu thịt nạc vai đƣợc thu thập trong khoảng thời gian 6h đến 6h30 sáng, chọn thịt cómàu hồng tƣơi, thớ thịt mịn đều, da mỏng, lớp mỡ có màu sáng bóng, có độ rắn. Mẫu đƣợc thu thập là 200g, ngày 5 tháng 9 năm 2014.