Qua nghiên cứu bản đồ cắt hạn chế của gen sec1, sơ đồ cấu trúc của vector biểu hiện pGS-21a, chúng tôi nhận thấy hai điểm cắt của enzym giới hạn BamHI và HindIII (các enzym có trong trình tự đoạn polylinker của vector pGS-21a) không có trong trình tự gen sec1 của S. aureus. Do đó, trình tự điểm cắt của 2 enzym BamHI và HindIII
đƣợc bổ sung lần lƣợt vào đầu 5’ của cặp mồi xuôi và mồi ngƣợc tƣơng ứng. Trình tự mồi đƣợc thiết kế dựa trên trình tự gen sec1 với các thông số đƣợc thể hiện nhƣ sau: Mồi xuôi SEC-F (5'-TTTGGATCCGAGAGCCAACCAGACCCT-3') và mồi ngƣợc SEC-R (5'- TATAAGCTTTTATCCATTCTTTGTTGTAAGGTGGAC-3'), chữ đƣợc gạch chân là trình tự nhận biết của enzym giới hạn. Các đoạn mồi này đƣợc dùng trong phản ứng PCR để khuếch đại gen sec1từ DNA tổng số và phản ứng PCR sàng lọc những chủng đƣợc biến nạp thành công.
Từ cơ sở nguồn DNA tổng số tách từ S. aureus, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại gen sec1. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,2%, kết quả thể hiện ở Hình 3.2.
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agarose 1, 2%
M: thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2: đoạn gen sec1
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose (Hình 3.2) cho thấy với cặp mồi đặc hiệu SEC-F và SEC-R đã thu đƣợc sản phẩm PCR duy nhất, rõ nét, có kích thƣớc khoảng 800 bp, đúng với kích thƣớc lý thuyết khi thiết kế mồi (kích thƣớc của gen sec1 là 801 bp). Nhƣ vậy, đoạn DNA mang gen mã hóa protein SEC1 đã đƣợc khuyếch đại
75
đặc hiệu. Kết quả này chứng tỏ chƣơng trình và cặp mồi khuếch đại gen mã hóa cho protein SEC1 đã đƣợc thiết kế hợp lý về mặt lý thuyết và kỹ thuật. Sản phẩm PCR này đƣợc sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo.