Để có đƣợc IgY với độ tinh sạch cao làm nguyên liệu cho sản xuất que thử, IgY đƣợc tinh sạch từ lòng đỏ trứng theo phƣơng pháp của PetrHokder phát triển năm 2013 [84]. Sau đó dịch kháng thể thu đƣợc tiếp tục đƣợc tinh sạch bằng cột HiTrapTM IgY Purification HP 5ml (GE Healthcare), gồm các bƣớc sau:
66
Vỏ trứng đƣợc làm vỡ một cách cẩn thận và lòng đỏ đƣợc chuyển vào một thìa chuyên biệt dùng để tách lòng trắng khỏi lòng đỏ càng nhiều càng tốt. Chuyển lòng đỏ vào một giấy lọc và lăn trên giấy để loại bỏ hết lòng trắng trứng còn sót lại trên bề mặt lòng đỏ. Lòng đỏ sau khi đƣợc tách khỏi lòng trắng sẽ đƣợc chọc thủng bằng mũi dao nhọn vô trùng và đổ vào ống falcon 50ml vô trùng, đƣợc đo thể tích. Pha loãng lòng đỏ trứng với 1 thể tích PBS, 5 thể tích nƣớc cất, 1 thể tích HCl 0,5M, chỉnh pH = 5,0 với HCl 0,5M. Trộn đều dung dịch và làm đông ở -20oC. Tiếp theo, làm tan băng ở nhiệt độ phòng và lọc bằng giấy lọc.
Bước 2: Tủa phân đoạn IgY bằng NaCl
Thêm NaCl đến 8,8% vào dung dịch thu đƣợc sau khi lọc bằng giấy lọc, chỉnh pH = 4,0 với HCl 0,5M. Lắc đều ống dịch để tạo kết tủa trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm 3700g trong 20 phút. Tiếp theo, loại dịch nổi và hòa tan cặn thu đƣợc bằng PBS với thể tích bằng thể tích dịch lòng đỏ trứng.
Bước 3: Tinh sạch IgY theo quy trình tinh sạch protein bằng cột HiTrapTM IgY Purification HP 5ml theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
- Dịch kháng thể IgY thu đƣợc sau tinh sạch ở bƣớc 2 đƣợc lọc qua màng lọc Minipore có kích thƣớc lỗ lọc là 0,45 µm để loại bỏ các tạp chất trƣớc khi đƣợc lọc bởi cột Hi Trap TM5ml. Khả năng tinh sạch của cột này là 5ml.
- Xử lý mẫu: Dịch IgY thu đƣợc ở bƣớc 2 bổ sung thêm K2SO4 đến nồng độ 0,5M, pH 7,5.
- Rửa cột với 5 lần thể tích cột (25ml) ở mỗi đệm: đệm liên kết (20mM sodium phosphate: 0,5M K2SO4, pH 7,5), đệm rửa giải (20mM sodium phosphate, pH = 7,5), đệm làm sạch (20mM sodium phosphate, pH = 7,5 + 30% isopropanol), với tốc độ 0,5 đến 5ml/phút.
- Cân bằng lại cột bằng 25ml đệm liên kết (20mM sodium phosphate: 0,5M K2SO4, pH 7,5).
- Áp dụng với mẫu: sử dụng một xy lanh chứa mẫu, gắn xy lanh vào cột và bơm mẫu qua cột tinh sạch IgY. Giữ lại dịch qua cột sau khi gắn protein.
67
- Rửa, tách protein ra khỏi cột bằng 50 ml của đệm rửa giải với tốc độ 0,5 đến 5ml/phút và thu 2 ml ở mỗi phân đoạn sắc ký.
- Sau khi rửa giải, cột sắc ký đƣợc làm sạch với 40 ml của đệm làm sạch.
- Chuyển dung dịch protein thu đƣợc vào cột cô đặc protein, ly tâm 10.000 g trong 15 phút, bỏ dịch bên dƣới ống đựng, thu dịch đã cô đặc ở bên trên cột lọc.
- Sản phẩm protein đƣợc xác định nồng độ bằng máy Nano Drop ở bƣớc sóng 260/280, điện di SDS – PAGE trên gel polyacrylamid 12,5%.
2.3.3. Chế tạo que thử phát hiện nhanh một số loại độc tố SE và thử nghiệm để phát hiện độc tố SE trên thực phẩm đƣợc gây nhiễm thực nghiệm hiện độc tố SE trên thực phẩm đƣợc gây nhiễm thực nghiệm
Các bƣớc trong quy trình tạo que thử để phát hiện nhanh 5 loại độc tố ruột tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED và SEE trên thực phẩm đƣợc tóm tắt trong sơ đồ ở Hình 2.4 dƣới đây:
Hình 2.4 : Sơ đồ các bước tạo que thử phát hiện 5 loại độc tố ruột tụ cầu SEA, SEB, SEC1, SED và SEE trên thực phẩm
2.3.3.1. Thiết kế bộ que thử nhanh phát hiện một số độc tố ruột (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) của tụ cầu SEC1, SED và SEE) của tụ cầu
- Thiết kế bộ que thử:
68
+ Cố định kháng thể vạch thử nghiệm (IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E)) và kháng thể vạch kiểm chứng (IgY kháng BSA) lên màng nitrocellulose lần lƣợt ở vị trí 25mm và 30 mm kể từ đầu que thử (Hình 2.5)
+ Gắn các hợp phần của que thử: màng nitrocellulose, giấy thấm lên tấm lót plastic, màng đƣợc cắt thành từng que thử có bề rộng là 4 mm.
Hình 2.5. Sơ đồ que thử phát hiện nhanh các độc tố ruột tụ cầu
- Nguyên lý của bộ sinh phẩm:
+ Nếu độc tố không có trong mẫu phân tích, thì khi kháng nguyên SEC1 – nanocarbon di chuyển lên phía trên que thử, đi về phía vùng kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) sẽ gắn với kháng thể. Sự xuất hiện màu ở vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử không chứa độc tố tụ cầu. Ngƣợc lại, độc tố có trong mẫu phân tích, chúng sẽ cạnh tranh vị trí gắn với kháng nguyên cộng hợp để gắn với kháng thể tại vạch thử nghiệm. Do đó, sự không xuất hiện màu ở vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu phân tích chứa độc tố ruột tụ cầu.
+ Trong quy trình gắn nanocarbon-SEC1, BSA đƣợc bổ sung vào để phong bế các vị trí có thể liên kết với protein của nanocarbon. Do đó, khi cộng hợp nanocarbon dịch chuyển lên vạch kiểm chứng đƣợc cố định kháng thể IgY kháng BSA thì BSA có
69
gắn nanocarbon sẽ liên kết với kháng thể kháng BSA nên xuất hiện màu ở vạch kiểm chứng trên que thử.
Kết quả phân tích đƣợc đánh giá dƣ̣a vào viê ̣c xu ất hiện vạch. Kết quả đƣợc coi là dƣơng tính nếu chỉ xuất hiện vạch kiểm chứng . Ngƣơ ̣c la ̣i, kết quả đƣợc coi là âm tính nếu xuất hiện tín hiệu tại cả vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng .
* Gắn cộng hợp nanocarbon cho kháng nguyên SEC1 tái tổ hợp
Kháng nguyên SEC1 tái tổ hợp sau khi tinh sạch đƣợc gắn với hạt nano carbon 100 nm theo khuyến cáo của n hà sản xuất (Maiia Diagnostics). Quy trình chuẩn bi ̣ đƣơ ̣c tóm tắt nhƣ sau: dung dịch huyền phù carbon nồng đô ̣ 10 mg/ml đƣợc pha loãng 10 lần trong dung di ̣ch đê ̣m borat 5 mM, pH 8,5 để thu nhận dung dịch có nồng độ 1 mg/ml. Tiếp đó, dung dịch huyền phù này đƣợc siêu âm trong 2 phút bằng máy siêu âm Sonics VibraCell với 30% biên đô ̣. Sau đó, 50 µg SEC1 chứa trong thể tích 500 μl dung dịch đệm borat 5 mM; pH 8,5 đƣợc trộn đều với 500 µl dung dịch huyền phù ha ̣t carbon 1mg/ml. Sau khi ủ 1 giờ ở 30oC, hỗn hợp đƣợc bổ sung 1% BSA và tiếp tục trộn trong 30 phút. Hỗn hợp đƣợc rửa bằng cách ly tâm 14.000 g trong 20 phút, loại bỏ dịch nổi, thêm vào 500 μl dung dịch đệm bảo quản (đệm borat 100 mM; pH 8,5, 1% BSA; 0,02% NaN3). Bƣớc rửa đƣợc lặp lại 3 lần. Phức hợp phát hiện kháng nguyên - nano carbon đƣợc chứa trong 500 μl dung dịch đệm bảo quản, để trong bóng tối, ở 4°C.
* Cố định kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) và IgY kháng BSA lên màng nitrocellullose
Màng nitrocelullose AE99 (Whatman) đƣợc cố định lên các lá vinyl Mylar AD back 79373 (Whatman). Kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) và kháng thể IgY kháng BSA đƣợc phun lên trên màng nitrocellulose lần lƣợt ở vạch thử nghiệm và va ̣ch kiểm chƣ́ng b ằng thiết bị Linomat V (CAMAG, Thụy Sĩ). Ở vị trí vạch thử nghiệm trên màng, lƣơ ̣ng kháng thể đƣợc phun lên màng từ 0,2 µg; 0,6 µg đến 2 µg/que thử, ở vạch kiểm chứng , lƣợng kháng thể đƣợc phun là 0,04 µg; 0,12 µg và 0,4µg/que thử. Vị trí cố định c ủa vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng lần lƣợt là 25mm và 30 mm kể từ đầu que thử. Sau đó, màng đƣợc ủ ở 37oC qua
70
đêm để làm khô. Sau khi gắn thêm giấy thấm, màng đƣợc cắt thành từng que thử có bề rộng là 4 mm bằng máy cắt Autokun.
- Lựa chọn lượng kháng thể in lên vạch kiểm chứng
Kháng thể IgY từ lô gà tiêm kháng nguyên BSA sau khi tinh sạch đƣợc cố định lên vạch kiểm chứng của que thử với liều lƣợng khác nhau: 0,4 µg; 0,12 µg và 0,04 µg /que thƣ̉. Tiếp đó, sử dụng các que thử này để phân tích với liều lƣợng kháng thể cộng hợp là 2 µl/100 µl đệm chạy (100 mM borat, pH 8,8; 0,5% Casein; 0,1% Tween 20; 0,02% NaN3).
- Lựa chọn lượng kháng thể in lên vạch thử nghiệm
Kháng thể IgY kháng 5 loại độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) sau khi tinh sạch đƣợc cố đi ̣nh lên vạch thử nghiệm với liều lƣợng khác nhau : 0,2 µg; 0,6 µg và 2 µg /que thƣ̉. Vạch kiểm chứng đƣợc in kháng thể IgY kháng BSA với hàm lƣợng là nồng độ đƣợc lựa chọn ở kết quả thí nghiệm lựa chọn lƣợng kháng thể in lên vạch kiểm chứng (hàm lƣợng kháng thể thấp nhất mà cho vạch kiểm chứng rõ nét). Tiếp đó, sử dụng các que thử này để phân tích mẫu âm tính với liều lƣợng kháng thể cộng hợp là 2 µl/100 µl đệm chạy.
2.3.3.2. Xác định giới hạn phát hiện và tính ổn định của que thử * Xác định giới hạn phát hiện của que thử nhanh * Xác định giới hạn phát hiện của que thử nhanh * Xác định giới hạn phát hiện của que thử nhanh
- Pha loãng các độc tố nguyên chất (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE) với nồng độ từ 1 đến 1000 ng/ml (1; 3; 10; 30; 100; 300; 1000 ng/ml). Mỗi mẫu phân tích đƣợc nhiễm chủ động một trong các nồng độ độc tố trên cho vào trong100 µl dung dịch đệm chạy (100 mM borat, pH 8,8; 0,5% Casein; 0,1% Tween 20) và đƣợc đƣa vào các đĩa vi giếng ELISA.
- Cắm que thử vào giếng và ủ trong 5 phút. Sau đó thêm 2 µl dung di ̣ch cô ̣ng hơ ̣p phát hiê ̣n vào giếng , đảo trô ̣n đều và que thƣ̉ đƣợc tiếp tục nhúng vào giếng và ủ trong 15 phút để toàn bộ lƣợng dung dịch trong giếng đƣợc hút cạn. Đọc kết quả.
- Nồng độ của độc tố SE thấp nhất cho kết quả dƣơng tính đƣợc xác định là giới hạn phát hiện của que thử.
71
Que thử đƣợc chia lô và bảo quản trong điều kiện khác nhau bao gồm: bảo quản ở nhiệt độ 25oC và ở 4oC, sau đó thử nghiệm khả năng phát hiện của que thử với độc tố chuẩn SE ở những khoảng thời gian 1 tháng lấy mẫu một lần để kiểm tra, trong 6 tháng.
2.3.3.3. Thử nghiệm que thử nhanh phát hiện độc tố ruột tụ cầu trên một số nhóm mẫu thực phẩm đã gây nhiễm độc tố SE
* Chuẩn bị mẫu
- Đối với mẫu sữa tƣơi tiê ̣t trùng: Pha loãng sữa tƣơi tiệt trùng trong đê ̣m cha ̣y (100 mM borat, pH 8,8; 0,5% Casein; 0,1% Tween 20; 0,02% NaN3), theo các tỷ lệ sữa: đệm chạy tƣơng ứng là: 1:0; 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; 1:6; 1:7; 1:8; 1:9. Sau đó lấy 100 µl dịch thu đƣơ ̣c cho vào giếng , sử dụng lƣợng kháng nguyên cộng hợp đã tối ƣu hóa để thử nghiệm. Mức độ pha loãng sữa thích hợp là mức độ pha loãng sữa thấp nhất mà tại đó vạch kiểm chứng và vạch thử nghiệm của que thử xuất hiện rõ nét.
- Đối với mẫu thịt : Tiến hành xay hoă ̣c nghiền mi ̣n sản phẩm thịt lợn trong cối sƣ́, sau đó cân 3 g sản phẩm trong mỗi ống Falcon 50 ml, gồm 8 ống. Bổ sung độc tố SEC1 với các nồng độ 30, 60, 90 và 120 ng/g lần lƣợt vào 4 ống, 4 ống không bổ sung độc tố.Thêm dung di ̣ch đê ̣m chạy (100 mM borat, pH 8,8; 0,5% Casein; 0,1% Tween 20; 0,02% NaN3) vào mỗi ống lần lƣợt theo các tỷ lê ̣ thịt: đệm chạy tƣơng ứng là 1: 2; 1: 4; 1: 6 và 1: 8 rồi tiến hành đảo trô ̣n đều . Tiến hành song song các kiểm chứng âm tính với các tỷ lệ trên. Tiếp đó, lọc dung dịch thu đ ƣợc bằng giấy lọc . Chuyển 100 µl dịch lọc vào giếng . Tiến hành phân tích các mẫu này bằng que thử. Tỷ lệ pha loãng thấp nhất của mẫu thịt mà tại đó vạch kiểm chứng và vạch thử nghiệm xuất hiện rõ nét sẽ đƣợc sử dụng cho các thử nghiệm đối với các que thử đƣợc chế tạo.
* Sử dụng que thử nhanh trên một số nhóm mẫu thực phẩm được gây nhiễm độc tố ruột tụ cầu với các nồng độ khác nhau
- Tiến hành nhiễm chủ động các nồng độ kháng nguyên SEA; SEB; SEC1; SED và SEE tinh khiết đã đƣợc pha loãng với các nồng độ 3000 ng/ml, 900 ng/ml, 300 ng/ml, 90 ng/ml, 30 ng/ml, 9 ng/ml và 3 ng/ml vào thực phẩm (mẫu sữa, mẫu thịt). Sau
72
đó làm thử nghiệm phát hiện độc tố ruột tụ cầu SE trong thực phẩm bằng que thử nhanh, mỗi mẫu đều đƣợc thử nghiệm lặp lại 3 lần.
Sơ đồ tổng hợp quá trình chế tạo que thử để phát hiện nhanh một số độc tố ruột tụ cầu trên thực phẩm đƣợc thể hiện ở Hình 2.6 dƣới đây:
Hình 2.6. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát quy trình chế tạo que thử
73
Số liệu thu thập đƣợc xử lý thống kê và xử lý bằng phần mềm MicroSoft Excel. Các chỉ số đƣa ra trong quá trình phân tích: tỷ lệ phần trăm, giá trị trung bình, độ lệch chuẩn p.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.1. SẢN XUẤT VÀ TINH CHẾ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU SEC1 TÁI TỔ HỢP
3.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ S. aureus
Hình ảnh điện di kiểm tra kích thƣớc DNA tổng số của chủng S. aureus P240 (Hình 3.1) cho thấy có 1 băng sáng rõ có kích thƣớc lớn ở trên cao, đó chính là DNA tổng số của S. aureus. Ngoài ra, bên dƣới xuất hiện một dải băng sáng mờ hơn DNA tổng số có thể là DNA plasmid, RNA có kích thƣớc nhỏ, những hợp phần này đã chạy nhanh hơn so với các DNA tổng số nên nằm ở phía dƣới. Nhƣ vậy, quy trình tách chiết đã thu đƣợc sản phẩm DNA đạt chất lƣợng để sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR khuếch đại gen sec1.
Hình 3.1. Điện di đồ DNA tổng số tách từ S. aureus
74
3.1.2. Khuếch đại gen sec1 bằng kỹ thuật PCR
Qua nghiên cứu bản đồ cắt hạn chế của gen sec1, sơ đồ cấu trúc của vector biểu hiện pGS-21a, chúng tôi nhận thấy hai điểm cắt của enzym giới hạn BamHI và HindIII (các enzym có trong trình tự đoạn polylinker của vector pGS-21a) không có trong trình tự gen sec1 của S. aureus. Do đó, trình tự điểm cắt của 2 enzym BamHI và HindIII
đƣợc bổ sung lần lƣợt vào đầu 5’ của cặp mồi xuôi và mồi ngƣợc tƣơng ứng. Trình tự mồi đƣợc thiết kế dựa trên trình tự gen sec1 với các thông số đƣợc thể hiện nhƣ sau: Mồi xuôi SEC-F (5'-TTTGGATCCGAGAGCCAACCAGACCCT-3') và mồi ngƣợc SEC-R (5'- TATAAGCTTTTATCCATTCTTTGTTGTAAGGTGGAC-3'), chữ đƣợc gạch chân là trình tự nhận biết của enzym giới hạn. Các đoạn mồi này đƣợc dùng trong phản ứng PCR để khuếch đại gen sec1từ DNA tổng số và phản ứng PCR sàng lọc những chủng đƣợc biến nạp thành công.
Từ cơ sở nguồn DNA tổng số tách từ S. aureus, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại gen sec1. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,2%, kết quả thể hiện ở Hình 3.2.
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agarose 1, 2%
M: thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2: đoạn gen sec1
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose (Hình 3.2) cho thấy với cặp mồi đặc hiệu SEC-F và SEC-R đã thu đƣợc sản phẩm PCR duy nhất, rõ nét, có kích thƣớc khoảng 800 bp, đúng với kích thƣớc lý thuyết khi thiết kế mồi (kích thƣớc của gen sec1 là 801 bp). Nhƣ vậy, đoạn DNA mang gen mã hóa protein SEC1 đã đƣợc khuyếch đại
75
đặc hiệu. Kết quả này chứng tỏ chƣơng trình và cặp mồi khuếch đại gen mã hóa cho protein SEC1 đã đƣợc thiết kế hợp lý về mặt lý thuyết và kỹ thuật. Sản phẩm PCR này đƣợc sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo.
3.1.3. Xây dựng vector biểu hiện pGS-21a mang gen sec1
* Cắt đoạn gen sec1 bằng các enzym giới hạn
Sản phẩm của phản ứng PCR sau khi tinh sạch đƣợc cắt bằng enzym giới hạn