Nguyên lý của phƣơng pháp miễn dịch hấp phụ gắn enzym (ELISA) là dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể vốn đƣợc cố định trên một phiến nhựa (giá đỡ pha rắn) và việc sử dụng phản ứng enzym - cơ chất sẽ gây chuyển màu, qua đó để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên hoặc kháng thể cần phát hiện.
Trên thị trƣờng thế giới hiện nay có nhiều bộ sinh phẩm để phát hiện các SE trong thực phẩm (RIDASCREEN, TECRA, TRANSIA và VIDAS). Nguyên tắc hoạt động của các bộ sinh phẩm này đều dựa trên nguyên lý của kỹ thuật ELISA kẹp đôi. Đầu tiên, mô ̣t kháng thể đă ̣c hiê ̣ u nhâ ̣n biết SE sẽ đƣợc cố đi ̣nh lên bề mă ̣t của mô ̣t giếng nhƣ̣a. Sau quá trình rƣ̉a để loa ̣i bỏ các kháng thể không đƣợc cố đi ̣nh , mẫu phân tích sẽ đƣợc đƣa vào giếng. Nếu nhƣ trong mẫu phân tích có SE , khi đó sẽ xảy ra phản ứng giữa SE với kháng thể cố định ở giếng , tạo phức hợp kháng thể cố định - SE. Sau quá trình rửa để loại bỏ các liên kết không đặc hiệu , mô ̣t kháng thể thƣ́ hai gắn enzym và cũng có khả năng nhận biết đặc hiệu SE đƣợc đƣa vào giếng để ta ̣o ra mô ̣t phƣ́c hợp mới kháng thể cố đi ̣nh - SE - kháng thể gắn enzym. Tiếp đó, lại thực hiện quá trình rửa để loại bỏ phân tử kháng thể gắn enzym dƣ còn sót lại trong giếng . Cuối cùng, cơ chất của en zym đƣơ ̣c đƣa vào giếng . Dƣới tác du ̣ng của enzym , cơ chất sẽ chuyển hóa
32
thành sản phẩm có màu . Nhƣ vâ ̣y, dƣ̣a vào viê ̣c xuất hiê ̣n màu có thể phát hiê ̣n đƣợc SE trong mẫu phân tích . Đối với một số bộ sinh phẩm , cƣờng đô ̣ màu sẽ tỷ lệ thuận với nồng đô ̣ SE trong mẫu phân tích . Do vâ ̣y, bằng cách lâ ̣p đƣờng chuẩn , có thể định lƣơ ̣ng đƣợc SE trong thƣ̣c phẩm . Dƣới đây là các bộ sinh phẩm thƣơng mại trên thị trƣờng thế giới đang dùng để phát hiện các SE.
Bảng 1.4. Các bộ sinh phẩm thương mại được sử dụng để phát hiện các SE [97]
Tên bộ sinh phẩm Nguyên lý phân tích Độ nhạy(ng/ml) Thời gian phân tích (giờ) Nhà sản xuất Ridasreen SET A, B, C, D, E3 ELISA kẹp đôi dùng các đĩa vi giếng chuẩn 0,2-0,7 2,5 R-Biopharm Staphylococcal Enterotoxin (SET) Identification TECRA3
ELISA kẹp đôi
dùng đĩa vi giếng 1 4
Bioenterprises
Staphylococcal Enterotoxin (SET A-E) TECRA
ELISA kẹp đôi trong các đĩa vi giếng chuẩn
1 4 Bioenterprises
Transia Tube Staphylococcal Enterotoxins A, B, C, D, E
ELISA kẹp đôi dùng các ống nhƣ pha rắn
0,1 1 Diffchamb
Transia Plate Staphylococcal Enterotoxins A, B, C, D, E
ELISA kẹp đôi trong các đĩa vi giếng chuẩn
0,1 2 Diffchamb
Vidas Staph enterotoxin (SET)
ELISA kẹp đôi tự
động 1 1,5 BioMérieux
Toàn bộ quy trình phân tích để phát hiện các SE thƣờng kéo dài từ 1 đến 4 giờ tùy theo bộ sinh phẩm . Ngƣỡng phát hiện của các bộ sinh phẩm này thƣờng dao động
33
từ 0,1-1 ng/ml dịch mẫu phân tích, cho phép phát hiện đƣợc SE ở nồng độ rất thấp [60]. Tuy nhiên , nhƣợc điểm cơ bản của các bộ sinh phẩm này là cần một máy đọc ELISA chuyên dụng để phân tích kết quả , đồng thời, các bộ sinh phẩm này cũng cần các kỹ thuật viên có tay nghề cao khi sử dụng để tránh hiện tƣợng dƣơng tính giả nên yêu cầu này hạn chế đáng kể khả năng phân tích tại hiện trƣờng của các bộ sinh phẩm. Để đáp ứng nhu cầu phát hiện các SE trong các thực phẩm tại Việt Nam, đã có một số nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh SE. Dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật ELISA, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Đỗ Phúc đã chế tạo kháng thể đa dòng kháng độc tố SEA từ thỏ và sử dụng kháng thể này để chế tạo bộ sinh phẩm ELISA nhằm phát hiện SEA trong thực phẩm [8]. Khi so sánh với bộ sinh phẩm chuẩn của hãng TECRA, quy trình ELISA này cho độ tƣơng đồng về mặt kết quả là 95,5%. Năm 2008, Nguyễn Hoàng Minh và nhóm nghiên cƣ́u đã phát triển một bộ sinh phẩm dựa trên kỹ thuật ELISA kẹp đôi để phát hiện SEA trong các sản phẩm thịt và sữa. Về độ đặc hiệu, bộ sinh phẩm đã đƣợc chứng minh là không có các phản ứng chéo với các loại độc tố khác nhƣ SEB, SEC1, SED và SEE. Về độ nhạy, bộ sinh phẩm có thể phát hiện đƣợc SEA với ngƣỡng xác định khoảng 1 ng/ml sữa tiệt trùng, tƣơng đƣơng với các bộ sinh phẩm hiện đang đƣợc lƣu hành trên thị trƣờng [5]. Một ƣu điểm nổi bật khác của bộ sinh phẩm này là kết quả có thể đƣợc phân tích bằng mắt thƣờng , không cần sử dụng các máy đọc ELISA chuyên dụng , nên có thể đƣợc ứng dụng tại hiện trƣờng. Năm 2011, các bộ sinh phẩm này đã đƣợc sản xuất thử nghiê ̣m ở quy mô phòng thí nghiệm và thƣ̉ nghiê ̣m liên phòng ta ̣i ba phòng thí nghiê ̣m khác nhau . Các kết quả thƣ̉ nghiê ̣m cho thấy đối với mẫu nem chua , đô ̣ nha ̣y và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u tƣơng đối của bộ sinh phẩm đều đạt 100%, trong khi đó với các mẫu sƣ̃a tiê ̣t trùng có độ nhạy 100%, còn độ đặc hiệu là 83,3%. Các kết quả thử nghiệm bƣớc đầu này cho thấy tính chính xác của bộ sinh phẩm ELISA trong điều kiện phân tích tại hiện trƣờng là phụ thuộc vào kỹ thuật viên và chất nền (sữa hay nem chua).