Nghiên cứu phân lập các hợp chất phenolic từ một số thực vật Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ QUỲNH HOA NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT PHENOLIC TỪ MỘT SỐ THỰC VẬT VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU………………………………………………………………………………1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN…………………………………………………………….3 1.1 Các hợp chất phenolic thực vật ……………………………………………… 1.1.1 Giới thiệu hợp chất phenolic thực vật………………………………3 1.1.2 Phân loại hợp chất phenolic…………………………………………….3 1.1.3 Hoạt tính sinh học hợp chất phenolic…………………………….9 1.1.4 Phƣơng pháp chiết phân lập hợp chất phenolic………………….10 1.1.4.1 Phƣơng pháp chiết…………………………………………………….11 1.1.4.2 Phƣơng pháp phân lập tinh định cấu chế………………………………… 14 1.1.4.3 Định tính xác trúc………………………………………16 1.2 Giới thiệu Chẹo phong (Engelhardtia spicata Lesh ex Blume)… 19 1.2.1 Đặc điểm học…………………………………………………….19 thực vật Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học 1.2.2 Nơi sống hái……………………………………………………… 19 1.2.3 Công dụng thu Chẹo phong…………………………………… 19 1.1.4 Một số nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Engelhardtia (Juglandaceae)……………………………………………………….21 Ch-¬ng : NHIỆM VỤ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………23 2.1 NhiƯm vơ Luận văn 23 2.2 Ph-ơng pháp nghiên cứu.24 2.2.1 Các ph-ơng pháp phân tích, phân tách hỗn hợp phân lập hợp chất 24 2.2.2 Các ph-ơng pháp xác định cấu trúc 24 Chng : KT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………… 26 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu………………………………………………………… 26 3.2 Quy trình chiết phong…………………… 26 phần chiết 3.3 Phân tách phần (EG3)……………………………………….29 chiết 3.4 Phân tách phần (EG4)…………………………………………… 31 từ etyl chiết Chẹo axetat nƣớc Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học 3.5 Cấu trúc hợp chất đƣợc phân lập………………………………………….33 Chƣơng 4: THỰC NGHIỆM……………………………………………………….38 4.1 Thiết bị hóa chất…………………………………………………………… 38 4.2 Nguyên liệu thực vật…………………………………………………………….39 4.3 Điều chế phần phong……………………………… 39 4.4 Phân tích phân (EG3)……………………… 40 4.4.1 Phân tích sắc (EG3)……………… 40 ký chiết tách lớp phần mỏng 4.4.2 Phân tách phần (EG3)………………………………….40 4.5 Phân tách sắc kí (EG4)………………………………… 41 4.5.1 Phân tích sắc (EG4)…………………… 41 ký từ lớp chiết phần mỏng 4.5.2 Phân tách phần (EG4)……………………………………… 42 etyl chiết chiết cột Chẹo etyl etyl phần chiết phần chiết chiết axetat axetat axetat nƣớc nƣớc nƣớc 4.6 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất đƣợc phân lập…………… 43 KẾT LUẬN………………………………………………………………………….46 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………….47 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN CC (Column Chromatography): Sắc ký cột thường trọng lực dung môi 13 C-NMR (Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 DEPT (Distortionless Enhancement by Polarition Tranfer): Phổ DEPT ESI-MS (Electrospray Ionization-Mass Spectrometry): Phổ khối lượng phun bụi điện tử FC (Flash Chromatography): Sắc kí cột nhanh H-NMR (Proton Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton LC (Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng Mini-C (Mini-column Chromatography): Sắc kí cột tinh chế TLC (Thin-Layer Chromatography): Sắc kí lớp mỏng Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học MỤC LỤC CÁC HÌNH, CÁC BẢNG VÀ CÁC SƠ ĐỒ H×nh 1.1: Cấu trúc minh häa stilben lignin H×nh 1.2: Cấu trúc minh häa flavonoid, axit phenolic v tannin Hình 1.3: Cõy Cho phong ( Engelhardtia spicata Lesh ex Blume, Juglandaceae ) B¶ng 1.1: Phân loại hợp chất phenolic thiên nhiên Bảng 4.1: Hiệu suất điều chế phần chiết từ Chẹo phong Bảng 4.2: Phân tích phần chiết etyl axetat (EG3) TLC Bảng 4.3: Phân tích phần chiết nước (EG4) TLC Sơ đồ 1.1: Quy trình chung phân lập hợp chất phenolic Sơ đồ 3.1: Điều chế phần chiết hữu từ nguyên liệu thực vật Sơ đồ 3.2: Phân tách sắc kí phần chiết etyl axetat (EG3) Sơ đồ 3.3: Phân tách sắc kí phần chiết nước (EG4) Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học MỞ ĐẦU Các hợp chất phenolic thực vật axit phenolic, flavonoid flavonoid polyme ngày thu hút nhiều quan tâm tính chất chống oxi hóa, tác dụng phòng ngừa ung thư bệnh liên quan đến tim mạch hợp chất phenolic Các nghiên cứu (hóa học, dược lý học, lâm sàng) phần lý giải mối liên quan sức khỏe người việc tiêu thụ sản phẩm thực phẩm giàu hoạt chất phenolic thiên nhiên Các nghiên cứu theo hướng phát hợp chất có tác dụng dự phòng ung thư (cancer chemoprevention) thiết lập hướng ứng dụng hợp chất phenolic Các hợp chất phân tử nhỏ thường chất chống oxi hóa làm giảm phát triển bệnh ung thư cách ngăn chặn phát triển tế bào ung thư qua chế ngăn chặn hư hại ADN ức chế đảo ngược trình phát triển tế bào tiền ác tính có hư hại ADN Một chương trình nghiên cứu tác nhân dự phòng chống ung thư từ nguồn thực vật Việt Nam xây dựng sở lựa chọn nhóm hợp chất có cấu trúc tiềm năng; chương trình hợp chất phenolic có tác dụng dự phịng ung thư phát với tỷ lệ cao Chương trình nghiên cứu xác định thách thức đặt cho nhà hóa học hợp chất thiên nhiên cần có qui trình phân lập hiệu nhóm cấu trúc cần thiết từ nguồn nguyên liệu thực vật, qui trình phải dễ triển khai tiếp cho qui mô công nghệ phân lập lượng lớn hoạt chất hoạt chất hữu ích phát Các hợp chất phenolic chiếm vị trí đáng kể số nhóm hợp chất thiên nhiên có tác dụng dự phịng ung thư; chúng có cấu trúc đa dạng xuất phổ biến giới thực vật Việc phân lập hợp chất cho thử nghiệm hoạt tính sinh học thực phương pháp chiết sắc ký điều chế; nhiên phổ rộng độ tan hợp chất cho thấy qui trình phân lập nên giới hạn vào nhóm hợp chất phenolic Các sàng lọc sắc ký lớp mỏng Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học sơ xác định nhóm hợp chất phenolic phần chiết từ loài cây: Alnus nepalensis D Don (Betulaceae), Betula alnoides Buch Ham ex D Don (Betulaceae) Engelhardtia spicata Lesch ex Blume (Juglandaceae) Mục tiêu nghiên cứu luận văn xây dựng qui trình chiết phần chiết giàu hợp chất phenolic phân lập sắc ký hợp chất phenolic, sau cấu trúc xác các hợp chất phân lập xác định phương pháp phổ đại Qui trình áp dụng thành cơng để phân lập hợp chất phenolic thành phần từ Chẹo phong (E spicata Lesch ex Blume) Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học Chương TỔNG QUAN 1.1 Các hợp chất phenolic thực vật 1.1.1 Giới thiệu hợp chất phenolic thực vật [6] Các hợp chất phenolic hợp chất có nhiều vịng thơm với nhiều nhóm hydroxy Chúng phân bố rộng rãi giới thực vật sản phẩm trao đổi chất phong phú thực vật Hơn 8.000 cấu trúc phenolic tìm thấy, từ phân tử đơn giản axit phenolic đến chất polyme tannin Các hợp chất phenolic thực vật có tác dụng chống lại xạ tia cực tím ngăn chặn tác nhân gây bệnh, ký sinh trùng động vật ăn thịt, làm tăng màu sắc thực vật Chúng có khắp phận vậy, chúng phần thiếu chế độ ăn uống người Các hợp chất phenolic thành phần phổ biến thức ăn thực vật (trái cây, rau, ngũ cốc, ô liu, loại đậu, sô-cô-la, vv) đồ uống (trà, cà phê, bia, rượu, vv), góp phần tạo nên đặc tính cảm quan chung thức ăn thực vật Ví dụ, hợp chất phenolic làm tăng vị đắng, se trái nước trái cây, tương tác hợp chất phenolic, chủ yếu procyanidin glycoprotein nước bọt Các anthocyanin, sáu phân nhóm nhóm polyphenol thực vật lớn gọi flavonoid, tạo màu da cam, đỏ, xanh màu tím nhiều loại trái rau táo, quả, củ cải hành tây Các hợp chất phenolic biết đến hợp chất quan trọng ảnh hưởng đến hương vị khác biệt màu sắc loại rượu vang trắng, hồng đỏ, hợp chất phản ứng với oxy có ảnh hưởng đến việc bảo quản, lên men cất giữu rượu vang 1.1.2 Phân loại hợp chất phenolic [6, 10] Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học Các hợp chất phenolic có cấu trúc đa dạng chia thành 10 nhóm đưa Bảng 1.1 B¶ng 1.1: Phân loại hợp chất phenolic thiên nhiên Số nguyên tử cacbon C6 Phenol đơn giản Benzoquinon C6-C1 C6-C2 Nguồn gốc thực vật Cấu trúc Nhóm OH O O Axit benzoic Acetophenon COOH Cranberry, ngũ cốc CH3 Táo, mơ, chuối, súp lơ O Axit phenylaxetic COOH C6-C3 Axit cinnamic COOH CH2 Phenylpropen Cà rốt, cam, quýt,cà chua, rau bina, đào, ngũ cốc, lê, cà tím Cà rốt, cần tây, cam chanh, rau mùi tây O Coumarin O Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học Chương THỰC NGHIỆM 4.1 Thiết bị hóa chất Phân tích sắc kí lớp mỏng (TLC) thực mỏng tráng silica gel Merck (Darmstadt, CHLB Đức) Alufolien 60 F254 chiều dày 0,2 mm nhôm Thuốc thử màu dung dịch sắt (III) clorua 5% Phân tách sắc kí cột thường (CC) thực trọng lực dung môi Phân tách sắc kí cột nhanh (FC) thực áp suất khơng khí nén Chất hấp phụ dùng cho sắc kí cột silica gel Merck (Darmstadt, CHLB Đức) cỡ hạt 40-63 μm Cột tách sắc kí thủy tinh Sigma-Aldrich với kích thước khác nhồi silica gel theo phương pháp nhồi ướt đến chiều cao 30 cm Sắc kí cột tinh chế (Mini-C) thực với chất hấp phụ silica gel Merck (Darmstadt, CHLB Đức) cỡ hạt 40-63 μm 15-40 μm Cột tách sắc kí cho Mini-C cột Pasteur pipette (0,7 cm cm i.d.), nhồi silica gel đến chiều cao 10 cm Phân tách sắc ký CC pha đảo thực chất hấp phụ nhựa polyme Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemicals, Nhật Bản) Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS) ghi thiết bị Water Auto Spec Premier Mass spectrometer Phổ khối lượng phun bụi điện tử (ESI-MS) ghi thiết bị LC-MSOrbitrap-XL (Thermo Scientific, Hoa Kỳ) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) (500 MHz) ghi thiết bị Brucker A V 500 spectrometer Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) (125 MHz) với chương trình DEPT ghi thiết bị Brucker AV 500 spectrometer 35 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học Độ chuyển dịch hóa học (δ) đo theo ppm Tetrametylsilan (TMS) chất chuẩn nội zero (δ = 0,00) ppm 4.2 Nguyên liệu thực vật Lá Chẹo phong (Engelhardtia spicata Lesch ex Blume, Juglandaceae) thu thập vào tháng 11 năm 2007 Tam Sơn, Phú Thọ Mẫu thực vật nhà thực vật học, TS Trần Ngọc Ninh, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam thu thập giám định 4.3 Điều chế phần chiết từ Chẹo phong Lá Chẹo phong (Engelhardtia spicata Lesch ex Blume, Juglandaceae) tươi rửa sạch, phơi se bóng râm sấy 45-50oC ngày Nguyên liệu thực vật xay thành bột mịn (3 kg) ngâm chiết metanol khan nhiệt độ phòng lần, lần ngày Sau lọc bỏ phần bã dịch chiết metanol gộp lại cất loại kiệt dung môi áp suất giảm 50oC Phần chiết metanol tổng hòa nước cất chiết phân lớp với dung môi hữu có độ phân cực tăng dần: n-hexan, điclometan etyl axetat Các dịch chiết làm khan Na2SO4 cất loại kiệt dung môi áp suất giảm, cho phần chiết điều chế từ Chẹo phong gồm phần chiết n-hexan (EG1), điclometan (EG2) etyl axetat (EG3) Dịch nước cô kiệt áp suất giảm cho phần chiết nước (EG4) Quy trình điều chế phần chiết từ Chẹo phong trình bày Sơ đồ 3.1, Chương 3: Kết Thảo luận Khối lượng hiệu suất điều chế phần chiết từ Chẹo phong trình bày Bảng 4.1 35 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học Bảng 4.1: Hiệu suất điều chế phần chiết từ Chẹo phong STT Phần chiết Ký hiệu Khối lượng (g) Hiệu suất (%)* n-hexan EG1 51,6 1,60 điclometan EG2 11,4 0,37 etyl axetat EG3 15,0 0,50 nước EG4 20,0 0,67 * tính theo khối lượng nguyên liệu khô ban đầu (3 kg) 4.4 Phân tích phân tách phần chiết etyl axetat (EG3) 4.4.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EG3) Sắc ký lớp mỏng (TLC) thực mỏng tráng sẵn silica gel Merck Alufolien 60 F254 dày 0,2 mm nhôm (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) Thuốc thử màu dung dịch FeCl3 5% Phần chiết etyl axetat (EG3) phân tích TLC với hệ dung môi n-hexanetyl axetat-axit fomic với tỷ lệ 20:19:1 10:19:1,5 Kết phân tích TLC trình bày Bảng 4.2 Bảng 4.2: Phân tích phần chiết etyl axetat (EG3) TLC Hệ dung môi (n-hexan-etyl axetat-axit fomic) 20:19:1 10:19:1,5 STT Rf Dạng vệt Hiện màu 2 0,35 0,22 0,45 0,22 0,15 0,10 Trịn Trịn Hình cung Trịn Trịn Trịn Nâu Nâu Nâu Nâu Nâu Nâu 4.4.2 Phân tách phần chiết etyl axetat (EG3) Phần chiết etyl axetat (EG3) (15 g) phân tách sắc ký cột thường (CC, cm i d  40 cm) silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 μm) với hệ dung môi nhexan-etyl axetat-axit fomic 20:19:1 10:19:1,5 35 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học Các phân đoạn phân tách thu theo 50 ml phân tích TLC Các phân đoạn có sắc ký đồ giống gộp lại cất loại dung môi áp suất giảm thu nhóm phân đoạn từ EG3.1 đến EG3.5 (n-hexan-etyl axetat-axit fomic 20:19:1và từ EG3.6 đến EG3.9 (n-hexan-etyl axetat-axit fomic10:19:1,5) Tinh chế phân đoạn EG 3.9 Phân đoạn EG 3.9 (52mg) phân tách sắc kí cột Mini-C silica gel (40-63 μm), hệ dung môi CH2Cl2-CH3OH với tỉ lệ 11:1 (100 ml), 10:1 (50 ml) 9:1 (25 ml), thu ml/ phân đoạn cho chất EG3.9.1 (chất III) EG3.9.2 (chất IV) Quá trình phân tách phần chiết EG3 nêu Sơ đồ 3.2, Mục 3.3, Chương 3: Kết Thảo luận 4.5 Phân tách sắc kí cột phần chiết nƣớc (EG4) 4.5.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng phần chiết nƣớc (EG4) Sắc ký lớp mỏng (TLC) thực mỏng tráng sẵn silica gel Merck Alufolien 60 F254 dày 0,2 mm nhôm (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) Thuốc thử màu dung dịch FeCl3 5% Phần chiết nước (EG4) phân tích TLC với hệ dung môi diclometanmetanol với tỷ lệ 7:1 5:1 Kết phân tích TLC trình bày Bảng 4.3 Bảng 4.3: Phân tích phần chiết nước (EG4) TLC Hệ dung môi (diclometan-metanol) 7:1 5:1 STT 2 Rf Dạng vệt 0,4 0,62 0,48 0,75 0,72 Trịn Hình cung Trịn Trịn Trịn 35 Hiện màu Nâu Xanh Nâu Nâu Tím Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học 4.5.2 Phân tách phần chiết nƣớc (EG4) Phần chiết nước (EG4) hòa tan MeOH, lọc hút chân không phễu lọc Buchner đưa trực tiếp lên cột Phần chiết nước phân tách sắc kí cột (CC) pha đảo chất hấp phụ polyme Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemicals), kích thước cột tách cm i.d  50 cm, rửa giải hệ dung môi H2O, MeOH-H2O gradient với tỉ lệ 20% MeOH, 40% MeOH, 60% MeOH MeOH Các phân đoạn phân tách thu theo 250 ml hết chất rửa giải (phân tích TLC) Các phân đoạn rửa giải với hệ dung môi gộp lại, sau cất loại kiệt dung mơi áp suất giảm cho nhóm phân đoạn: EG4.1 (20%MeOH), EG 4.2 (40% MeOH) (5,3 g), EG4.3 (60% MeOH) (5 g) EG4.4 (MeOH) (9,7 g) Quá trình phân tách phần chiết EG4 nêu Sơ đồ 3.3, Mục 3.4, Chương 3: Kết Thảo luận Phân tách phân đoạn EG4.3 Phân đoạn EG4.3 phân tích sắc kí lớp mỏng (TLC, silica gel, Merck) với hệ dung môi triển khai CH2Cl2-CH3OH với tỉ lệ 9:1, 7:1 5:1 Phân đoạn EG4.3 phân tách sắc kí cột CC silica gel (63-200 μm), kích thước cột tách 20  1,5 cm i.d, hệ dung môi gradient CH2Cl2-CH3OH với tỉ lệ 15:1 (100 ml ), 9:1 (500 ml), 5:1 (200 ml) n-hexan-EtOAc-axit fomic với tỉ lệ 10:20:1 (200 ml) Các phân đoạn phân tách thu theo 20 ml phân tích sắc kí lớp mỏng, phân đoạn có TLC giống gộp lại, cất loại dung môi áp suất giảm cho nhóm phân đoạn Tinh chế phân đoạn EG 4.3.1 (73 mg) sắc kí cột Mini-C silica gel (4063 μm), hệ dung môi CH2Cl2-CH3OH với tỉ lệ 40:1 (100 ml), 20:1 (25 ml) 12:1 (25 ml), thu ml/phân đoạn cho chất EG4.3.1.1 (chất I) chất EG4.3.1.2 (chất II) 35 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học Tinh chế phân đoạn EG 4.3.2 (0,6 g) sắc kí cột Mini-C silica gel (40-63 μm), hệ dung môi CH2Cl2-CH3OH với tỉ lệ 12:1 (200 ml), 10:1 (25ml) 9:1 (25 ml), thu ml/phân đoạn cho chất EG4.3.2 (chất III) Tinh chế phân đoạn EG 4.3.4 (0,3 g) Mini-C silica gel (40-63 μm), hệ dung môi CH2Cl2-CH3OH với tỉ lệ 12:1 (50 ml), 11:1 (100 ml) 10:1 (25 ml) thu ml/phân đoạn cho chất EG4.3.4 (chất IV) 4.6 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất đƣợc phân lập 3,5,7-Trihydroxychromon (chất I) Bột vơ định hình màu trắng, phát quang tử ngoại cho màu trắng, màu nâu với thuốc thử FeCl3 5% H-NMR (CD3OD): δ 6,19 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,30 (1H, d, J = 2,0 Hz, H- 6), 7,89 (1H, s, H-2) 13 C-NMR/DEPT (CD3OD): δ 94,6 (d, C-8), 99,5 (d, C-6), 106,5 (s, C-10), 141,4 (d, C-2), 141,7 (s, C-3), 159,5 (s, C-9), 163,1 (s, C-5), 165,7 (s, C-7), 178,4 (s, C-1) Aromadendrin (chất II) Bột vơ định hình màu trắng, phát quang tử ngoại cho màu trắng, màu nâu với thuốc thử FeCl3 5% ESI-MS: m/z 287,03 [M H], 289,10 [M + H]+, 311,18 [M + Na]+ H-NMR (CD3OD): δ 4,56 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-3), 4,99 (1H, d, J = 12,0 Hz), 5,90 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 5,94 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,85 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2, H-6), 7,37 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3, H-5) 13 C-NMR/DEPT (CD3OD): δ 73,6 (d, C-3), 84,9 (d, C-2), 96,3 (d, C-8), 97,3 (d, C-6), 101,9 (s, C-10), 116,1 (d, C-2, C-6), 129,3 (s, C-1), 130,4 (d, C-3, C-5), 159,2 (s, C-4), 164,6 (s, C-9), 165,3 (s, C-5), 168,7 (s, C-7), 198,5 (s, C-4) 35 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học 3,5,7-Trihydroxychromon 3-O--L-rhamopyanosid (Eucryphin) (chất III) Bột vơ định hình màu trắng, phát quang tử ngoại cho màu trắng, màu nâu với thuốc thử FeCl3 5% ESI-MS: m/z 339,05 [M H], 341,85 [M + H]+, 363,16 [M + Na]+ H-NMR (CD3OD): δ 1,30 (1H, d, J = 6,0 Hz, CH3-6), 3,48 (1H, t, J = 9,5 Hz, H-4), 3,78 (1H, m, H-5), 3,85 (1H, dd, J = 10,5 Hz, 2,5 Hz, H-3), 4,15 (1H, dd, J = 3,0 Hz, 2,0 Hz, H-2), 5,34 (1H, dd, J = 1,5 Hz, H-1), 6,23 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,35 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 8,13 (1H, s, H-2) 13 C-NMR/DEPT (CD3OD): δ 17,9 (q, C-6), 71,2 (d, C-5), 71,6 (d, C-2), 71,9 (d, C-3), 73,5 (d, C-4), 94,9 (d, C-8), 100,0 (d, C-6), 102,1 (d, C-1), 106,5 (s, C-10), 140,4 (s, C-3), 147,9 (d, C-2), 159,3 (s, C-9), 163,5 (s, C-5), 166,2 (s, C-7), 178,7 (s, C-4) Taxifolin 3-O--L-rhamnopyranosid (Astilbin) (chất IV) Tinh thể hình kim màu vàng đ.n.c 179-180oC, phát quang tử ngoại cho màu vàng, màu nâu với thuốc thử FeCl3 5% ESI-MS: m/z 449,09 [M H], 451,74 [M + H]+, 474,04 [M + Na]+ H-NMR (CD3OD): δ 1,21 (1H, d, J = 6,0 Hz, CH3-6), 3,32 (1H, m, H-4), 3,56 (1H, dd, J = 3,0 Hz, 1,5 Hz, H-2), 3,68 (1H, dd, J = 10,0 Hz, 3,0 Hz, H-3), 4,06 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-1), 4,27 (1H, dd, J = 10,0 Hz, 6,0 Hz, H-5), 4,60 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,09 (1H, d, J = 10,5 Hz), 5,92 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 5,94 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,82 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5), 6,86 (1H, dd, J = 8,0 Hz, 2,0 Hz, H-6), 6,97 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-2) 13 C-NMR/DEPT (CD3OD): δ 17,9 (q, C-6), 70,5 (d, C-5), 71,8 (d, C-2), 72,2 (d, C-3), 73,8 (d, C-4), 78,6 (d, C-3), 83,9 (d, C-2), 96,3 (d, C-8), 97,4 (d, C-6), 102,2 (s, C-1), 102,5 (s, C-10), 115,5 (d, C-2), 116,3 (d, C-6), 120,5 (d, C-5), 129,1 35 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học (d, C-1), 146,6 (s, C-3), 147,4 (s, C-4), 164,1 (s, C-9), 165,5 (s, C-5), 168,6 (s, C-7), 195,9 (s, C-4) 35 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học KẾT LUẬN Luận văn tốt nghiệp “Nghiên cứu phân lập hợp chất phenolic từ số loài thực vật Việt Nam” thực nhiệm vụ nghiên cứu phân lập hợp chất phenolic từ Chẹo phong Luận văn hoàn thành nhiệm vụ nghiên cứu đạt kết sau: Đã xây dựng qui trình chiết hợp chất phenolic vào phần chiết etyl axetat (EG3), hiệu suất chiết 0,5% so với lượng nguyên liệu khô phần chiết nước (EG4) từ Chẹo phong Đã phân tích sắc kí lớp mỏng (TLC) phần chiết etyl axetat phần chiết nước để xác định điều kiện sắc ký phân tích định tính, xác định hệ dung mơi thích hợp cho phân tách sắc ký điều chế gradient phần chiết phenolic kiểm tra trình phân tách Bằng qui trình phân tách hợp chất phenolic phân cực kết hợp sắc ký cột thường (CC) gradient, sắc ký cột tinh chế (Mini-C) kết tinh lại phân lập hợp chất chromon hợp chất flavonoit từ phần chiết etyl axetat phần chiết nước Sử dụng phương pháp phổ đại ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR DEPT lần xác định cấu trúc hợp chất phenolic thành phần Chẹo phong 3,5,7-trihydroxychromon (I), aromadendrin (II), 3,5,7-trihydroxychromon 3-O--L-rhamopyanosid (eucryphin) (III) taxifolin 3-O--L-rhamnopyranosid (astilbin) (IV) Astilbin chứng tỏ hợp chất có tác dụng chống oxi hóa, làm giảm nồng độ cholesterol lipid gan 35 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Thành phố Hồ Chí Minh, tr 226 Tiếng Anh Agarwal, C., Veluri, R., Kaur, M., Chou, S C., Thompson, J A.; Agarwal, R (2007),“Fractionation of high molecular weight tannins in grape seed extract and identification of procyanidin B2-3,3'-di-O-gallate as a major active constituent causing growth inhibition and apoptotic death of DU145 human prostate carcinoma cells”, Carcinogenesis, 28, pp 1478-1484 Asquith, T N., Izuno, C C., Butler, L G (1983), “Characterization of the condensed tannin (proanthocyanidin) from a group II sorghum”, J Agric Food Chem, 31, pp 1299-1303 Castro-Vargas, H.I., Rodríguez-Varela, L.I., Ferreira, S.R.S., ParadaAlfonso, F (2010), “Extraction of phenolic fraction from guava seeds (Psidium guajava L.) using supercritical carbon dioxide and co-solvents”, J Supercrit Fluid., 51, pp 319-324 Chu, T Y., Chang, C H., Liao, Y C., Chen, Y C (2001), “Microwaveaccelerated derivatization processes for the determination of phenolic acids by gas chromatography-mass spectrometry”, Talanta, 54, pp 1163-1171 Dai, J.; Mumper, R J (2010), “Plant Phenolics: Extraction, Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties”, Molecules, 15, pp 7313-7352 De Paule M Moreira, F., Coutinho, V., Montanher, A B P., Caro, M S B., Brighente, I M C.; Pizzolatti, M G (2003), “Flavonoids and Triterpenes from 35 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học Bacchsis psendotenui folia - Bioactivity on Arternisia salina”, Quim Nova, 26, pp 309-311 Dobiáš, P., Pavlíková, P., Adam, M., Eisner, A., Beňová, B., Ventura, K (2010), “Comparison of pressurised fluid and ultrasonic extraction methods for analysis of plant antioxidants and their antioxidant capacity”, Cent Eur J Chem, 8, pp 87-95 Ek, S., Kartimo, H., Mattila, S., Tolonen, A (2006), “Characterization of phenolic compounds from lingonberry (Vaccinium vitis-idaea)”, J Agric Food Chem, 54, pp 9834-9842 10 Garcia-Salas, P., Morales-Soto, A., Segura-Carretero, A., Fernández-Gutiérrez, A (2010), “Phenolic-Compound-Extraction Systems for Fruit and Vegetable Samples”, Molecules, 15, pp 8813-8826 11 Gómez, A M, Carrasco, A, Cañabate, B, Segura, A, Fernández, A (2005), “Electrophoretic identification and quantitation of compounds in the polyphenolic fraction of extra-virgin olive oil”, Electrophoresis, 26, 3538-3551 12 Hagerman, A E., Butler, L G (1980), “Condensed tannin purification and characterization of tannin-associated proteins” J Agric Food Chem, 28, pp 947-952 13 Igarashi, K., Uchida, Y., Murakami, N., Mizutani, K., Masuda, H (1996), “Effect of astilbin in tea processed from leaves of Engelhardtia chrysolepis on the serum and liver lipid concentrations and on the erythrocyte and liver antioxidative enzyme activities of rats”, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 60, pp 513-515 14 Jac, P., Polasek, M., Pospisilova, M (2006), “Recent trends in the determination of polyphenols by electromigration methods” J Pharm Biomed Anal, 40, pp 805-814 35 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học 15 Jáuregui, O., Galceran, M T (2001), Handbook of Analytical Separations; University of Barcelona, Barcelona, Spain, Chapter 6, pp 196 16 Kaehkoenen, M P., Heinaemaeki, J., Ollilainen, V., Heinonen, M (2003), “Berry anthocyanins: Isolation, identification and antioxidant activities”, J Sci Food Agric, 83, pp 1403-1411 17 Kasai, R.; Hirono, S., Chou, W H., Tanaka, O., Chen, F H (1988), “Sweet dihydro flavonol rhamnofide from leaves of Engelhardtia chrysolepis, a Chinese folk medicine, Hung-gi”, Chem Pharm Bull., 36, pp 4167-4170 18 Klejdusa, B., Kopecký, J., Benesˇová, L., Vaceka, J (2009), “Solidphase/supercritical-fluid extraction for liquid chromatography of phenolic compounds in freshwater microalgae and selected cyanobacterial species”, J Chromatogr A, 1216, pp 763-771 19 Liazid, A., Palma, M., Brigui, J., Barroso, G C (2007), “Investigation on phenolic compounds stability during microwave-assisted extraction”, J Chromatogr A, 1140, pp 29-34 20 Llorach, R.; Gil-Izquierdo, A., Ferreres, F., Tomas-Barberan, F A (2003), “HPLC-DAD MS/MS ESI characterization of unusual highly glycosylated acylated flavonoids from cauliflower (Brassica oleracea L var botrytis) agroindustrial byproducts”, J Agric Food Chem, 51, pp 3895-3899 21 Lin, Y., Zhang, C., Zhang, M (2009), “Chemical constituents in herbs of Polygonum jucundum”, China Journal of Chinese Materia Medica, 34, pp 1690-1691 22 Liu, H.; Wang, S., Cai, B., Yao, X (2004), “Anticancer activity of compounds isolated from Engelhardtia serrata stem bark”, Archives of Physiology and Biochemistry, 42, pp 475-477 35 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học 23 Lúcia Q A Galotta, A., Amélia D Boaventura, M., A R S Lima, L (2008), “Antioxidant and cytotoxic activities of Euterpe precatoria Mart” Quim Nova, 31, pp 1427-1430 24 Mahugo, C., Sosa, Z., Torres, M.E., Santana, J.J (2009) “Methodologies for the extraction of phenolic compounds from environmental samples: new approaches”, Molecules, 14, pp 298-320 25 Naczk, M., Shahidi, F (2006), “Phenolics in cereals, fruits and vegetables: occurrence, extraction and analysis” J Pharm Biomed Anal, 41, pp 1523-1542 26 Palma, M., Piñeiro, Z., Barroso, C.G (2002), “In-line pressurized-fluid extraction-solid-phase extraction for determining phenolic compounds in grapes”, J Chromatogr A, 968, pp 1-6 27 Picouet, P A., Landl, A., Abadias, M., Castellari, M., Viñas, I (2009), “Minimal processing of a Granny Smith apple purée by microwave heating”, Innov Food Sci Emerg, 10, pp 545-550 28 Pinelo, M.; Laurie, V.F., Waterhouse, A.L (2006), “A simple method to separate red wine nonpolymeric and polymeric phenols by solid-phase extraction”, J Agric Food Chem, 54, pp 2839-2844 29 Ranilla, L G., Genovese, M I., Lajolo, F M (2007), “Polyphenols and antioxidant capacity of seed coat and cotyledon from Brazilian and Peruvian bean cultivars (Phaseolus vulgaris L.)”, J Agric Food Chem, 55, pp 90-98 30 Ray Sahelian, M D (2006), Polyphenols supplement research study, health benefit 31 Ross, K A.; Beta, T.; Arntfield, S D (2009), “A comparative study on the phenolic acids identified and quantified in dry beans using HPLC as affected by different extraction and hydrolysis methods”, Food Chem, 113, pp 336- 344 35 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học 32 Vilkhu, K.; Mawson, R., Simons, L., Bates, D (2008), “Applications and opportunities for ultrasound assisted extraction in the food industry”, Innov Food Sci Emerg., 9, pp 161-169 33 Wu, C C.; Peng, C F.; Tsai, I L.; Abd El-Razek M H.; Huang H S.; Chen I S (2007), “Secondary metabolites from the roots of Engelghardia roxburghiana and their antitubercular activities” Phytochemistry, 68, pp 1338-1343 34 Zhang, Y., Seeram, N.P., Lee, R., Feng, L., Heber, D (2008), “Isolation and identification of strawberry phenolics with antioxidant and human cancer cell antiproliferative properties J Agric Food Chem., 56, pp 670-675 35 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR chất EG4.3.1.1 Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR DEPT chất EG4.3.1.1 Phụ lục 3: Phổ ESI-MS (+) chất EG4.3.1.2 Phụ luc 4: Phổ ESI-MS (-) chất EG4.3.1.2 Phụ lục 5: Phổ 1H-NMR chất EG4.3.1.2 Phụ lục 6: Phổ 13C-NMR DEPT chất EG4.3.1.2 Phụ lục 7: Phổ ESI-MS (+) chất EG3.9.1 Phụ lục 8: Phổ ESI-MS (-) chất EG3.9.1 Phụ luc 9: Phổ 1H-NMR chất EG3.9.1 Phụ lục 10: Phổ 13C-NMR DEPT chất EG3.9.1 Phụ luc 11: Phổ ESI-MS (+) chất EG4.3.4 Phụ lục 12: Phổ ESI-MS (-) chất EG4.3.4 Phụ lục 13: Phổ 1H-NMR chất EG4.3.4 Phụ lục 14: Phổ 13C-NMR DEPT chất EG4.3.4 35