Khoá luận tốt nghiệp nghiên cứu phân lập các hợp chất phenolic glucoside từ cây râu hùm (tacca chantrieri)

Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn nên tôi chọn đề tài cho khóa luận tốt nghiệp là: “Nghiên CÚĨI phân lập các hợp chất phenolic glucoside từ cây Râu hùm Tacca chanừieri ” Với mục đích nghiên

TRƯỜNG ĐẠI HỌC su' PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA HÓA HỌC

PHẠM THỊ KIM HOÀN

NGHIÊN CÚXJ PHÂN LẶP CÁC HỢP CHẤT PHENOLIC

GLUCOSIDE TÙ CÂY RÂU HÙM (TACCA CHANTRIERI)

TÓM TẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ

Người hưóng dẫn khoa học

TS Phạm Hải Yến

Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại phòng Nghiên cún cấu trúc, Viện Hóa sinh biển-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Trước tiên, em xin chân thành cảm ơn TS Phạm Hải Yến và các anh

chị hướng dẫn trong Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp Với tất cả lòng kính trọng và lòng biết ơn chân thành,

em xin cảm ơn thầy giáo PGS-TS Nguyễn Văn Bằng người đã tận tình, chu

đáo dạy bảo em trong suốt những năm học ở trường và hoàn thiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa Học- Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện và giúp đỡ, dạy dỗ em trong quá trình học tập tại trường Xin cảm ơn tất cả các bạn bè đã động viên giúp đỡ em trong quá trình học tập và làm khóa luận

Trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp này mặc dù đã hết sức cố gắng nhung chắc chắn không thể tránh được những thiếu sót Vì vậy em kính mong nhận được ý kiến đóng góp, chỉ bảo của các quý thầy cô

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2014

Sinh viên

Phạm Thị Kim Hoàn

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy'H-'H Chemical Shift Correlation SpectroscopyPhổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two-DimensionalNMR

Sắc ký cột Column ChromatographyDistortionless Enhancement by Polarisation TransferPhổ khối lượng va chạm electron

Electron Impact Mass SpectroscopyPhố khối lượng ban phá nguyên tử nhanhFast Atom Bombardment Mass SpectrometryHeteronuclear Multiple Bond ConnectivityHeteronuclear Multiple Quantum CoherencePhổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao HighResolution Fast Atom Bombardment Mass spectrometryPhổ hong ngoại Infrared Spectroscopy

Nhóm metylPhổ khối lượng Mass Spectroscopy Nucler Overhauser Effect Spectroscopy Sac ký lóp mỏng Thin Layer Chromatography

Hình 1.1: Cây Râu hùm 3

Hình 1.2: Cấu trúc của phenol và các acid phenolic 22

Hình 1.3: Flavan (2-phenyl chromen) 23

Hình 1.4: Lỉgnan 23

Hình 1.5: 3,3f-Neolignan 24

Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của một số coumarỉn 24

Hình 3.1: Sơ đồ chiết phân đoạn cây Râu hùm (Tacca chantrieri) 45

Hình 3.2: Sơ đồ phân lập các họp chất từ cặn EtOAc 46

Hình 4.2: Phổ 13C-NMR hợp chất 1 49

Hình 4.3 Cấu trúc phân tử của họp chất 1 49

Bảng 4.1: Số liệu phổ NMR của chất 1 và chất tham khảo 50

Hình 4.4: Phổ ESI-MS của chất 1 51

Hình 4.5: Phổ ^-N M R họp chất 2 52

Hình 4.6: Phổ ,3C-NMR hợp chất 2 53

Hình 4.7: Cấu trúc họp chất 2 53

Hình 4.9: Phổ DEPT họp chất 2 53

Bảng 4.2: Số liệu phổ NMR của chất 2 và chất tham khảo 54

Hình 4.8: Phổ ESI-MS hợp chất 2 55

M ỤC LỤC

CHƯƠNG 1: TỐNG Q U A N 3

1.1 Những nghiên cứu tổng quan về cây Râu h ù m 3

ỉ l ỉ Thực vật học 3

1.1.2 Mô tả c â y 3

1.1.3 Phân bố và sinh th á i 3

1.1.4 Bộ phận dùng 4

1.1.5 Thành phần hóa h ọ c 4

1.1.6 Tỉnh vị, công n ă n g 17

1.1.7 Công dụng 17

1.1.8 Hoạt tính sinh học 17

1.1.9 Một sổ bài thuốc từ cây Râu h ù m 18

1.2 Lóp chất phenolic, thành phần hóa học có trong cây Râu hù m 19

1.2.1 Giói thiệu chung [6, 2 6 ] 19

1.2.2 Các nhóm phenolic [6, 2 7 ] 21

1.2.3 Hoạt tỉnh sinh học của các hợp chất phenolỉc [6] 24

1.3 Các phương pháp chiết mẫu thực vật 27

1.3 ỉ Chọn dung môi chiết 27

1.3.2 Quá trình chiết 29

1.4 Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ 31

1.4.2 Cơ sở của phương pháp sắc kỉ 31

ỉ 4.3 Phân loại các phương pháp sẳc kỉ 32

1.5 Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu c ơ 36

1.5.1 Phổ hồng ngoại ( ỈR) 37

1.5.2 Phổ khối lượng (MS) 37

1.5.3 Phô cộng hưởng từ hạt nhân 38

CHƯƠNG 2: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 42

2.1 Mầu thực v ậ t 42

2.2 Phương pháp phân lập các hợp c h ấ t 42

2.2.1 Sắc kỉ lóp mỏng (TLC) 42

2.2.3 Sắc kỉ cột (CC) 42

2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất 42

2.3.1 Điềm nóng chảy (Mp) 42

2.3.2 Phổ khối lượng (ESI-MS) 42

2.3.3 Phố cộng hưởng từ hạt n h â n 43

2.4 Dụng cụ và thiết b ị 43

2.4.1 Dụng cụ và thiết bị tách chiết 43

2.4.2 Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc 43

2.5 Hoá ch ất 43

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 45

3.1 Phân lập các hợp c h ấ t 45

3.2 Hằng số vật lí và dữ kiện phổ các hợp c h ấ t 46

KÉT LUẬN 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

Trường Đại học S ư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

M Ở ĐẦU

Nước ta có khí hậu và thảm thực vật khá phong phú và đa dạng Dân tộc Việt Nam có truyền thống về sử dụng các loài thảo mộc làm thuốc chữa bệnh Những năm gần đây xu hướng tìm kiếm một số hoạt chất trong các loài thảo mộc có tác dụng chữa bệnh ngày một tang và thu hút các nhà khoa học nghiên cứu Theo các số liệu thống kê mới nhất thảm thực vật Việt Nam có trên 12000 loài, trong số đó có trên 3200 loài được sử dụng làm thuốc trong y học dân gian [1]

Từ xưa đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò hết sức quan trọng trong việc chăm sóc sức khỏe cho con người Ngày nay những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp và y tế Chúng được sử dụng làm thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm Mặc dù công nghiệp tổng họp hóa dược ngày nay đã phát triển mạnh mẽ, tạo ra các biệt dược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh, nhờ đó giảm tỷ lệ từ vong rất nhiều song những đóng góp của các thảo dược cũng không vì thế mà mất đi chỗ đứng trong Y học Các thảo dược vẫn tiếp tục được dùng như là nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp nhũng chất đầu cho công nghiệp bán tổng họp nhằm tìm kiếm những dược phâm mới cho việc điều trị các chứng bệnh thông thường cũng như các bệnh nan y

Trong thế giới thực vật, nhiều loài cây cỏ được sử dụng như những

dược liệu quý Trong số đó có cây Râu hùm (tên khoa học là Tacca chantrỉerỉ

Andre) Theo kinh nghiệm dân gian, Râu hùm thường được dùng chữa viêm loét dạ dày và hành tá tràng, viêm gan, huyết áp cao, bỏng lửa, lở ngứa, giải

kháng khuẩn, kháng u, chống tụ tiêu cầu [7-24] Trong đó, đáng chú ý nhất

là hoạt tính gây độc tế bào Vậy nên đây là cây thuốc quý, cần được nghiên cứu đế giải thích tác dụng chữa bệnh của cây và tạo cơ sở để tìm kiếm phương thuốc điều trị bệnh

Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn nên tôi chọn đề tài cho khóa luận tốt nghiệp là:

“Nghiên CÚĨI phân lập các hợp chất phenolic glucoside từ cây Râu hùm (Tacca chanừieri) ”

Với mục đích nghiên cứu thành phần phenolic glucoside từ rễ cây Râu hùm và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập Từ đó tạo cơ

sở cho những nghiên cún tiếp theo trong lĩnh vực tìm các phương thuốc mới cũng như giải thích được tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc cổ truyền Việt Nam Đây là yếu tố quan trọng có ý nghĩa to lớn đối với sự phát triển của nền

y học

Nhiệm vụ chính của đề tài là :

1 Thu mẫu 1'ễ cây Râu hùm (Tacca chantrieri), xử lý mẫu và tạo dịch

Trường Đại học sIVphạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

C H Ư Ơ N G 1: TỎ N G QUAN 1.1 Những nghiên cửu tổng quan về cây Râu hùm

Cây Râu hùm hay còn được gọi với

nhiều tên gọi khác nhau như: phá lủa, hoa mèo

đen, co nốt khao (Tày), nưa, hoa quỷ dữ, cẩm

địa la, pinh đỏ (K'dong), cu dòm (Ba Na), Tza

dụ (Mông), bèo nìm sam (Dao) , có tên khoa

học là Tacca chantrieri Andre, thuộc họ râu

hùm (Taccaceae) Cây thảo sống lâu năm, cao

50-80cm Thân bò dài, có nhiều đốt Lá mọc

thắng tù’ thân rễ, có phiến hình trái xoan nhọn,

dài 25-60cm, rộng 7-20cm, màu lục bóng, mép

nguyên lượn sóng, cuống lá dài 10-30cm Hoa

màu tím đen mọc tụ họp thành tán trên một cán

thẳng hay cong dài 10-15cm; bao chung của tán

có 4 lá bắc màu tím nâu, các lá bắc ngoài hình

trái xoan, nhọn mũi, các lá bắc trong hình trái

xoan, thuôn nhon ở gốc, các sơi bất thu dài tới T¥X , , , , N

TT 1 í ' ± 1 ! s , X , Hì nh 1.1: Cây Râu hùm

25cm Hoa có cuông đài, 6 nhị, bâu dưới có lôi

đính noãn bên Quả không tự mở, hạt có 3 cạnh,

màu đỏ tím [2]

1.1.3 Phân bố và sinh thái

Ở nước ta , có 6 loài, trong đó Râu hùm là loài có phạm vi phân bố rộng rãi nhất Theo thống kê chưa đầy đủ của Viện Dược liệu từ năm 1986, Râu hùm đã phát hiện được ở 26 tỉnh miền núi và trung du Vùng phân bố của cây chủ yếu tập trung ở các tỉnh miền núi từ Tây Nguyên trở ra, bao gồm Gia Lai, Kon Tum, Quảng Nam, Quảng Bình, Nghệ An, Thanh Hoá, Ninh Bình, Hoà Bình, Sơn La, Tuyên Quang, Yên Bái, Thái Nguyên Có thể trồng bằng thân rễ như trồng Nghệ vào mùa xuân, mùa thu Ở Nghệ An, loài cây này đã được tìm thấy ở Vườn Quốc gia Pù Mát với nhiều giá trị về kinh tế và dược liệu.

1.1.4 Bộ phận dùng

Thân rễ - Rhizoma Taccae Thân rễ có thể thu hái quanh năm, rủa sạch, thái lát phơi hay sấy khô

1.1.5 Thành phần hóa học

Trong các nghiên cứu về thành phần hóa học của một vài loài thuộc chi

Tacca cho thấy có chứa các lớp chất lignan, steroid, phenolic

Năm 1996, Zhong - Liang Chen và cộng sự đã phân lập được 5 họp chat steroids dạng khung y-enol-lactone đó là các taccalonolides G(l), H(2), 1(3), J(4) và K(5) [20]

Cấu trúc hóa học của các họp chất này như sau:

21

1

Trường Đại học S ư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Năm 2001, từ thân rễ của Tacca chantrỉerỉ, Akihito Yokosuka và cộng

sự đã phân lập được hai họp chất mới đó là hai diaryheptanoid (6-7) và bảy

diaryheptanoid glucosides (8-14) [25].

Cấu trúc hóa học của các họp chất này như sau:

OH OH

Trường Đại học S ư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

9

Năm 2002, tiếp tục cô lập được ba hợp chất mới đó là ba saponin

bisdesmosidic furostanol (15-17), hai saponin bisdesmosidic pseudofurostanol (18,19) và hai pregnane glycoside (20, 21) [8].

Trường Đại học S ư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Cấu trúc hóa học của các họp chất này như sau:

Hai glucoside withanolide mới đó là chantriolides A (22) và B (23) được phân lập từ thân 1'ễ của Tacca chantrieri [11].

Cấu trúc hóa học của các họp chất này như sau:

Trường Đại học S ư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học S ư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Năm 2006, Hai Yang Liu và cộng sự đã phân lập được năm

\vithanolide mới có tên plantagiolides A-E (34, 36-39), chantriolide A (35)

cùng với một glucoside withanolide đã biết từ loài Taccs plantaginea [19].

Cấu trúc hóa học của các hợp chất này như sau:

Cũng từ loài Taccs plantaginea nhóm cộng sự của Tran Hong Quang

đã phân lập được hai hợp chất glucoside withanolide mới là Plantagiolides I-J (40,41) [31]

Trường Đại học sIVphạm Hà Nội 2 Khóa luận tắt nghiệp

Năm 2009, Lin Zhang và cộng sự đã phân lập được withanolide, chantriolide c và một spirostanol saponin mới, là chantrieroside cô lập từ thân

rễ của Tacca chantrieri, các steroid và cấu trúc của họ đã được thành lập như (22/?)-1 a, 12a-diacetoxy-2a,3«;6a,7a-diepoxy-27-[(jổ-D-glucopyranosyl)oxy]-

5a-hydroxy-with-24-enolide và rhamnopyranosyl-( 1 —>2)-ỡ- [ơ-/?-D-glucopyranosyl-( 1 —>4)-a-L-

(25/?)-spirost-5-en-3-yl-ỡ-a-L-rhamnopyranosyl- (1—>3)]-/?-D-glucopyranoside [15]

Năm 2011, Jiangnam Peng và cộng sự đã phân lập được bốn steroidals

có tên gọi Taccalonolide R,T,AA,AB (42,43,44,45) từ thân rễ của Tacca

chantrieri [32].

42

Trường Đại học S ư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

1.1.6 Tính v/, công năng

Thân rễ Râu hùm có vị cay đắng, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, chống viêm, chỉ thống, lương huyết, tán ứ Ở Trung Quốc, thân rễ được dùng trị nhiều bệnh, trong đó có viêm loét dạ dày và hành tá tràng, viêm gan, huyết

áp cao, bỏng lửa, lở ngứa, giải độc ngộ độc thực phẩm; có tác dụng thanh nhiệt giải độc, tiêu viêm chỉ thống lương huyết, tán ứ

1.1.7 Công dụng

Theo Đông y, Râu hùm thường được dùng chữa thấp khớp Ở Trung Quốc, cây được dùng uống trị lao lực, viêm loét dạ dày và hành tá tràng, viêm gan, huyết áp cao, đau dạ dày, bỏng lửa, lở ngứa Dùng uống trong: 10- 12g rễ khô sắc lấy nước uống; dùng ngoài: giã nát bôi hoặc nghiền vụn thành bột đắp

1.1.8 Hoạt tính sinh học

Thành phần hóa học của chi Tacca gồm các họp chất dạng phenolic,

saponin steroid, ílavonoids các hợp chất này thể hiện hoạt tính gây độc tế bào, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng u, chống tụ tiểu cầu [7-24] Trong

8-14 được phân lập, chúng đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào khá tốt với các dòng tế bào ung thư máu (HL-60), ung thư vòm họng (HSC-2) [7] Từ

thân rễ loài T.chantrieri, năm hợp chất khung steroidal saponin được phân lập

và kết quả thử nghiệm cho thấy họp chất này có tác dụng diệt bào ung thư

máu (HL-60) [10] Từ thân rễ loài T.chantrieri hai họp chất taccalonolide E

và taccalonolide A được phân lập Ket quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng ung thư buồng trứng (SK-OV-3), ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư vú (MDA-MB-435) cho thấy hai họp chất này có hoạt tính tương đương taxol một hợp chất đang được dùng điều trị ung thư [11] Cũng

từ 1'ễ loài này, hợp chất evelynin thuộc khung benzoquinone được phân lập kết quả thử nghiệm cho thấy họp chất này có hoạt tính đối với 4 dòng tế bào:

tế bào ác tĩnh (MDA-MB-435), ung thư vú (MDA-MB-231), ung thư tuyến tiền liệt (PC-3), ung thư máu với giá trị IC50 lần lượt là 4,1, 3,9, 4,7 và 6,3

|Lig/ml [17] Từ cây T.subỷĩabellata các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập

được 9 hợp chất trong đó 1 hợp chất dạng sapogenin và 8 hợp chất dạng steroidal skeletons glycosides: taccasubosides A-D, plantagiolide, chantriolide A-B, diosgenin 3-0-a-L-rhamnopyranosyl(l—>2)-[a-L-rhamnopyranosyl( 1 —>3)]-ị3-D-glucopyranoside, 26-0-|3-D-glucopyranosyl-(25S)-3Ị3,22ậ,26-triol-furost-5-ene 3-0-a-L-rhamnopyranosyl(l—>2)-[a-L-rhamnopyranosyl(l—>6)]-Ị3-D-glucopyranoside Ket quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của các họp chất này trên 5 dòng tế bào ung thư HL-60, SMMC-7721, A549, MCF-7 và SW480 cho thấy hợp chất 26-0-Ị3-D- glucopyranosyl-(25S)-3ị3,22ậ,26-triol-furost-5-ene 3-O-a-L-rhamnopyranosyl (1—^-[a-L-rhamnopyranosyl (1—>6)]-Ị3-D-glucopyranoside có hoạt tính gây độc tế bào mạnh [21]

1.1.9 Một số bài thuốc từ cây Râu hùm

Trường Đại học S ư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Chữa tê thấp: Dùng 50g thân rễ Râu hùm khô giã nhỏ, trộn với 30g bồ kết nướng giòn, tán bột, ngâm vào 1/3 lít ruợu trong 1-2 tuần Dùng rượu này xoa bóp vào chỗ tê đau, ngày 2-3 lần

Kiêng kị: Phụ nữ có thai không được uống

1.2 Lóp chất phenolic, thành phần hóa học có trong cây Râu hùm

1.2.1 Giới thiệu chung [6, 26]

Các họp chat phenolic là các họp chất có một hoặc nhiều vòng thơm và một hoặc nhiều nhóm hydroxyl (-OH) tự do hoặc kết hợp với các nhóm chức khác như ether, ester hoặc glycosid Các hợp chat phenolic tan trong nước vì phần lớn đều ở dạng kết hợp với đường như một glycosid và thường ở trong không bào Các hợp chat phenol có màu sắc tự nhiên nên có thể lợi dụng màu sắc của chúng để theo dõi quá trình chiết suất và phân lập

Có hai hướng chính thơm hóa để sinh ra các phenolic thực vật:

Hướng phổ biến nhất là đi qua Shikimate (axit Shikimic), từ các monosaccarit tạo thành các aminoaxit (Phenyl amin và Tyrosime), sau đó loại nhóm amin cho các axit Cinnamic và các dẫn xuất của chúng gồm: Axit benzoic, Acetophenone, Lignan, Lignin và Caumarin

- Con đường thứ hai là đi từ axetat và dẫn đến tạo thành các Poly-ß-ketoester của các Polyketit dài bằng các phản ứng đóng vòng (phản úng ngưng tụ Claisen hoặc Andol) Các sản phẩm thường là polycyclic gồm: Choromen, Isocaumarin, Orcinol, Depside, Depsidoen, Xanthone, Quinone

Cấu trúc đa dạng của các hợp chat phenol có được là do quá trình sinh tổng hợp và bởi sự tăng dần tần số kết họp giữa hai con đường Shikimate và acetate đối với các họp chất được tạo thành trong hỗn họp Khả năng tham gia các thành tố thứ ba là hoàn toàn có thể mặc dù với tần số thấp hơn Sự kết họp

Một vài hợp chất của phenol có thế dễ dàng nhận biết bằng mắt thường như các Anthocyanin từ hoa, các họp chất khác có thể nhận biết dưới ánh sáng đèn ƯV hoặc bởi các phản ứng màu đặc trung Các phản ứng màu này được sử dụng trong quá trình sắc kí, phân lập các hợp chat phenolic.Tuy nhiên, việc sử dụng các phản ứng màu trên các dịch chiết thường khó phát hiện và không nhạy bởi các tương tác của các yếu tố gây nhiễu kết quả thực nghiệm Các hóa chất thường được sử dụng phát hiện các chất phenol đó là: Clorit sắt, Vanllinin, Phosphomolybdate-phosphotungstate Đối với một vài hóa chất, việc sử dụng các họp chất có cấu trúc phenol được thực hiện theo tính đặc hiệu như thời gian phản ứng, sự chuyến màu, nhũng điều này góp phần làm tăng khả năng nhận biết các họp chat phenol.

Chúng được phân bố rộng rãi trong giới thực vật và là các sản phẩm trao đổi chất phong phú của thực vật Hơn 8.000 cấu trúc phenolic đã được tìm thấy, từ các phân tử đơn giản như các axit phenolic đến các chất polyme như tannin, lignin, neoligman, melanin, Trong đó flavonoid là nhóm hợp chất lớn nhất nhưng là các phenol đơn vòng đơn giản, phenyl- propanoid và tất cả các quinon phenolic tồn tại tương đối nhiều [26]

Các họp chất phenolic được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm,vì nó

có khả năng ức chế chất sinh ung thư và là chất gây đột biến hoặc ngăn chặn các tác nhân gây bệnh, ký sinh trùng và động vật ăn thịt, cũng như làm tăng các màu sắc của thực vật Ví dụ, phenolic góp phần sự cay đắng và chát của trái cây và nước ép trái cây, vì sự tương tác giữa phenolic, chủ yếu là procyanidin, và glycoprotein trong nước bọt Anthocyan -một trong các thành phần polyphenol thực vật chịu trách nhiệm về cam, đỏ, xanh dương và màu tím của nhiều loại trái cây và rau quả như táo, dâu, củ cải và hành tây Chiết xuất phenolic hoặc polyphenol bị cô lập từ thức ăn thực vật khác nhau đã được nghiên cứu trong một số các dòng tế bào ung thư đại diện cho các giai đoạn tiến hóa khác nhau của ung thư Ví dụ, Ross và cộng sự cho thấy hoạt

Trường Đại học sIVphạm Hà Nội 2 Khóa luận tắt nghiệp

động kháng sinh chiết xuất mâm xôi trong tế bào của người bệnh ung thư cổ

tử cung (HeLa) đã được chủ yếu là liên quan đến ellagitannins [25] Isoflavone genistein có trong đậu nành có thể ức chế sự tăng trưởng của các dòng tế bào ung thư khác nhau bao gồm cả bệnh bạch cầu, ung thư hạch, tuyến tiền liệt, vú, phổi và đứng đầu là các tế bào ung thư cổ [30] Flavonoid cam quý ức chế mạnh mẽ sự phát triển của HL-60 bệnh bạch cầu tế bào [28] Ngoài ra, tác dụng chống oxy hóa và giảm đau của polyphenol đóng góp vào tác dụng điều trị dự phòng hoặc bảo vệ cơ thể Chúng có ở khắp các bộ phận của cây và vì vậy, chúng cũng là một phần không thể thiếu trong chế độ ăn uống của con người

1.2.2 Các nhóm phenolic [6,27]

Các họp chat phenolic có cấu trúc rất đa dạng và có thể được chia thành các nhóm chính sau:

1.2.2.1 Phenol và các acid phenolic

Phenol là các dẫn xuất benzen đơn giản nhất, ít tồn tại ở dạng tự do trong cây Acid phenolic là các dẫn xuất của acid benzoic (C6 - C l) và acid cinamic (C6- C3) Các phenol tự do và các acid phenolic thường cùng tồn tại trong cây, ở dạng kết họp như một glycosid đơn giản có mặt trong phân đoạn tan trong cồn Phổ biến nhất là các acid p - hydroxybenzoic, acid procatechuic, acid vanilic, Ngược lại với các acid trên, các phenol tự do trong cây thường tương đối hiếm Hydroquinon phổ biến nhất, ngoài ra còn gặp các catechol, orcinol,

1.2.2.1.1 Các phenol đơn giản

Các phenol đơn giản tồn tại nhiều trong cây, hydroquinon chỉ được tìm thấy trong vài họ thực vật, chủ yếu dưới dạng glycosid diphenol hay ether

Dần xuất của acid benzoic:

Các acid phenolic C6 - Cl là các dẫn xuất hydroxyl của acid benzoic tồn tại phổ biến ở trạng thái tự do, cũng như ở dạng kết họp ester (như acid salicylic) hay glycosid; acid procatechic, acid gallic ở dạng tự do và dạng ester có trong thành phần cấu tạo của tanin và một số catechin Các andehit tương ứng với các acid này như vanilin,anisaldehyd, cũng tồn tại tương đối phổ biến trong cây

Các acid phenolic - dẫn xuất của acid cinamic:

Hầu hết các acid phenolic C6 - C3, như acid p-coumaric, acid caffeic, ferulic, rất phổ biến trong thiên nhiên

Các phenol khác : như ancol phenol, aldehyd phenol (vanilin)

R

R= H, acid p-coumarin

R= OH, acid caffeic

Hình 1.2: Cấu trúc ciía phenol và các acid phenolic

I.2.2.2 Flavonoid

Flavonoid là một nhóm hợp chất poliphenol đa dạng về cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học Chúng có mặt ở hầu hết các bộ phận của cây, đặc biệt

R= OMe, acid sinapic

M eO

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

trong các tế bào thực vật, là hợp chất được cấu tạo gồm hai vòng benzen A, B được kết nối bởi 1 dị vòng c với khung các bon C6-C3-C6 Tại các vòng có đính một hay nhiều nhóm hydroxy tự do hay đã thay thế một phần Vì vậy về bản chất chúng là các poliphenol có tính axit Các poliphenol có thế phản ứng lẫn nhau qua các nhóm hydroxy để tạo thành các phân tử phức tạp hơn hay có thể liên kết với các họp chất khác trong cây như các Oza (dạng glicozit) hay protein

Các flavonoid là dẫn xuất của 2 - phenyl chroman (flavan)

Hình 1.3: Flavan (2-phenyl chromen)

I.2.2.3 Lignan

Lignan là các hợp chat diphenolic (C6 - C3)2, tạo dây nối đuôi - đuôi của 2 đơn vị acid cinamic Lignan được tạo thành do trùng hợp hóa 2 acid

cinnamic, là các hợp chất có khung là kết quả của liên kết giữa Ị5 carbon của

mạch nhánh với 2 đơn vị dẫn xuất của 1-phenylpropan (dây nối 8 - 8 ’)

Hình 1.4: Lỉgnan

Nếu 2 nhóm (C6 - C3) liên kết với nhau bởi các liên kết khác (thí dụ 8- 3’; 3-3’; 8-0-4’) ta được Neolignan, chẳng hạn 3 - 3 ’ thay cho 8 - 8’:

Hình 1.5: 3,3’-Neoỉignan

1.2.2.4.Coumarin

Coumarin là hợp chất hữu cơ có trong nhiều loài cây, được phát hiện

từ năm 1820 Coumarin là những dẫn chất a - pyron có cấu trúc C6 - C3 Benzo a -pyron là một coumarin đơn giản nhất tồn tại trong hạt cây họ Đậu

Cho đến nay, người ta đã biết đến gần 1000 coumarin khác nhau Trong coumarin các nhóm OH phenol được ether hóa bằng nhóm CH3 hay bằng một mạch tecpenoid từ 1 đến 3 đơn vị isoprenoid về mặt hóa học, coumarin có thể tồn tại dưới dạng tự do hay dạng kết họp với đường glucose tạo thành coumarin glycosid

o

Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của một số coumarin

Ngoài ra còn các nhóm khác như tanin, lignin, thymol, plikatit, melanin,

1.23 Hoạt tính sinh học của các hợp chất phenolic [6].

Các họp chat phenolic thực vật có tác dụng chống lại bức xạ tia cực tím hoặc ngăn chặn các tác nhân gây bệnh, ký sinh trùng và động vật ăn thịt cũng như làm tăng các màu sắc của thực vật Do sự phân bố rộng rãi của chúng trong hầu hết các bộ phận của cây vì thế các polyphenol đóng vai trò quan trọng đối với sức khỏe của con người nên chế độ ăn uống dinh dưỡng đã và đang được

Trường Đại học S ư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

chú ý trong nhũng năm gần đây Các nhà nghiên cún và các nhà sản xuất thực phẩm đã tập trung vào các polyphenol có đặc tính chống oxy hóa mạnh trong chế độ ăn uống, các hiệu úng đáng tin cậy của chúng trong việc phòng ngừa nhũng chứng bệnh căng thẳng oxy hóa liên quan Theo các nghiên cún dịch tễ học, hấp thụ các họp chất phenolic sẽ giảm được nguy cơ mắc các bệnh tim mạch ngăn ngừa được bệnh ung thư Hơn nữa các polyphenol còn có các tác dụng sinh lý học cụ thế trong việc ngăn ngừa và điều trị bệnh

Các hợp chất phenol như arbutin được dùng để sát trùng đường niệu, các hợp chất salycylat có tác dụng chống viêm, các ester của acid cinnamic trong actisô (như cynarin, các acid phenolic) có tác dụng bảo vệ gan Các ester của phenylpropanoid glycosid đã được chứng minh có nhiều tác dụng quan trọng như ức chế men CAMP phosphodiesterase (forsythiasid, planta- majosid), ức chế men aldose reductase (verbacosid) Verbacosid, forsythiasid

ức chế men 5-LO(5-lipoxygenase) trong bạch cầu hạt ở người và ở màng bụng chuột Nhiều hợp chất phenol có tác dụng kháng khẩn và kháng nấm Coumarin cũng có nhiều tác dụng dược lý quan trọng bao gồm chống đông máu, kích thích tố, làm nhạy cảm với da, diệt vi trùng, thuốc giãn mạch, diệt côn trùng, trừ giun sán, giảm đau, hạ nhiệt, làm bền và bảo vệ thành mạch như aesculetin, bergapten và fraxin Coumarin glycosid có tác dụng chống nấm và chống ung thư Coumarin và các dẫn xuất có khả năng kích thích đại thực bào nên có thể dùng làm thuốc điều trị vết bỏng và các vết thương do nhiệt Ngoài ra chúng còn gây nên sự thay đổi đáng kể trong điều hòa đáp ứng miễn dịch Chúng đóng vai trò gián tiếp qua sự điều biến của hệ miễn dịch chủ, do đó kích thích hoạt tính miễn dịch dẫn tới bảo vệ chống lại sự tái phát của khối u, hoặc giảm kích thước các khối u nhỏ và tác dụng trực tiếp ức chế

phát triển đối với dòng tế bào u ác tính in vitro, thí dụ dịch chiết metanol của

thư biểu mô cuống phổi) Trong khi, tác dụng ức chế ung thư của tannin chủ yếu do khả năng kết họp của tanin với các chất gây ung thư Tanin ở nồng độ cao ức chế hoạt động của các enzyme, nhưng ở nồng độ thấp chúng thường kích thích hoạt tính các enzyme Tanin đóng vai trò đặc biệt trong nén ép bề mặt màng nhầy sau khi vào cơ thể, vì vậy nó dùng để trị bệnh tiêu chảy nhung phải thải trừ ngay khỏi đường tiêu hóa bằng cách dùng thuốc nhuận tràng Ngoài ra tanin có tác dụng chống chảy máu, giảm đau và làm giảm nồng độ acid trong dạ dày Nước ép quả hồng có chứa nhiều tannin ngưng tụ được dùng ở Nhật để điều trị cao huyết áp và ngăn ngừa chứng đột quỵ Casuarinin,

tanin thủy phân được chiết xuất từ vỏ cây Termỉnalia arjiina Linn, có tác dụng ức chế virus Herpes typ 2 (HSV-2) in vitro Geraniin, một tanin thủy phân được có trong thành phần cây chó đẻ răng cưa (Phylanthus amarus

Chum, et Thonn.) được dùng để điều trị viêm gan virus do ức chế tín hiệu điều khiến protein kinase, hay ức chế tương tác giữa HBV enhacer I và các yếu tố dịch mã tế bào Thành phần polyphenol có tác dụng chống oxy hóa chính trong chè xanh Lignan và các cây có chứa lignan đã được sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền, chúng có tác dụng bảo vệ gan như schizandrin, iso schizandrin và các gomisin A, B, c, D, F và G tìm thấy trong quả cây ngũ

vị tử (Schizcindra chinensis (Turcz.) Baill., họ Ngũ vị - Schizandraceae) cho

thấy tác dụng bảo vệ gan rất tốt, tăng tổng họp protein gan được dùng để điều trị viêm gan mạn có men gan tăng, điều trị tổn thương gan, Lignan acid

nordihydroguaaretic - NDGA (trong cây Larrea mexỉcana) là một trong

những hợp chất thiên nhiên có tác dụng chống oxy hóa mạnh, ức chế men 5-

LO, ức chế tế bào ung thư được dùng làm thuốc chống oxy hóa, chống ung thư và chống viêm Nghiên cứu cho thấy Lignan và neolignan có tác dụng ức chế men, đặc biệt là men C-AMP phosphodiesterase và các men của quá trình

hô hấp, chống dị ứng và viêm khóp, ức chế yếu tố hoạt hóa tiểu cầu Một số lignan là dẫn xuất của xyclolignan naphtalenhay tetrahydro-naphtalen có tác

Trường Đại học S ư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

dụng chống virus Từ dịch chiết chó đẻ răng cưa, các nhà khoa học Thái Lan

đã chiết được 2 dẫn xuất của lignan là phylanthin và hydrophylanthin có hoạt tính đối với dòng tế bào ung thư KB-Vlđã kháng vinblastin Một số lignan có thể kết hợp với protein (kể cả enzyme), polysaccharide, acid nucleic tạo các phân tử có tác dụng kháng sinh và trừ sâu bọ cho cây

1.3 Các phưong pháp chiết mẫu thực vật.

Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất

có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình ) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

1.3.1 Chọn dung môi chiết

Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận

Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được nhũng chất chuyến hoá thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cún), không dễ bốc cháy, không độc

Nếu dung môi có lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết Vì vậy những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa

Methanol và chlorofrom thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl)-