Các họp chat phenolic có cấu trúc rất đa dạng và có thể được chia thành các nhóm chính sau:
1.2.2.1. Phenol và các acid phenolic
Phenol là các dẫn xuất benzen đơn giản nhất, ít tồn tại ở dạng tự do trong cây. Acid phenolic là các dẫn xuất của acid benzoic (C6 - C l) và acid cinamic (C6- C3). Các phenol tự do và các acid phenolic thường cùng tồn tại trong cây, ở dạng kết họp như một glycosid đơn giản có mặt trong phân đoạn tan trong cồn. Phổ biến nhất là các acid p - hydroxybenzoic, acid procatechuic, acid vanilic,... Ngược lại với các acid trên, các phenol tự do trong cây thường tương đối hiếm. Hydroquinon phổ biến nhất, ngoài ra còn gặp các catechol, orcinol,...
1.2.2.1.1. Các phenol đơn giản
Các phenol đơn giản tồn tại nhiều trong cây, hydroquinon chỉ được tìm thấy trong vài họ thực vật, chủ yếu dưới dạng glycosid diphenol hay ether
Dần xuất của acid benzoic:
Các acid phenolic C6 - Cl là các dẫn xuất hydroxyl của acid benzoic tồn tại phổ biến ở trạng thái tự do, cũng như ở dạng kết họp ester (như acid salicylic) hay glycosid; acid procatechic, acid gallic ở dạng tự do và dạng ester có trong thành phần cấu tạo của tanin và một số catechin. Các andehit tương ứng với các acid này như vanilin,anisaldehyd,... cũng tồn tại tương đối phổ biến trong cây.
Các acid phenolic - dẫn xuất của acid cinamic:
Hầu hết các acid phenolic C6 - C3, như acid p-coumaric, acid caffeic, ferulic,... rất phổ biến trong thiên nhiên.
Các phenol khác : như ancol phenol, aldehyd phenol (vanilin)
R
R= H, acid p-coumarin R= OH, acid caffeic
Hình 1.2: Cấu trúc ciía phenol và các acid phenolic
I.2.2.2. Flavonoid
Flavonoid là một nhóm hợp chất poliphenol đa dạng về cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học. Chúng có mặt ở hầu hết các bộ phận của cây, đặc biệt
OH R
OH Hydroquinon R= H, acid ferulic
R= OMe, acid sinapic
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
trong các tế bào thực vật, là hợp chất được cấu tạo gồm hai vòng benzen A, B
được kết nối bởi 1 dị vòng c với khung các bon C6-C3-C6. Tại các vòng có đính
một hay nhiều nhóm hydroxy tự do hay đã thay thế một phần. Vì vậy về bản chất chúng là các poliphenol có tính axit. Các poliphenol có thế phản ứng lẫn nhau qua các nhóm hydroxy để tạo thành các phân tử phức tạp hơn hay có thể liên kết với các họp chất khác trong cây như các Oza (dạng glicozit) hay protein.
Các flavonoid là dẫn xuất của 2 - phenyl chroman (flavan).
Hình 1.3: Flavan (2-phenyl chromen)
I.2.2.3. Lignan
Lignan là các hợp chat diphenolic (C6 - C3)2, tạo dây nối đuôi - đuôi của 2 đơn vị acid cinamic. Lignan được tạo thành do trùng hợp hóa 2 acid
cinnamic, là các hợp chất có khung là kết quả của liên kết giữa Ị5 carbon của
mạch nhánh với 2 đơn vị dẫn xuất của 1-phenylpropan (dây nối 8 - 8 ’).
Hình 1.4: Lỉgnan
Nếu 2 nhóm (C6 - C3) liên kết với nhau bởi các liên kết khác (thí dụ 8- 3’; 3-3’; 8-0-4’) ta được Neolignan, chẳng hạn 3 - 3 ’ thay cho 8 - 8’:
Hình 1.5: 3,3’-Neoỉignan
1.2.2.4.Coumarin
Coumarin là hợp chất hữu cơ có trong nhiều loài cây, được phát hiện
từ năm 1820. Coumarin là những dẫn chất a - pyron có cấu trúc C6 - C3.
Benzo a -pyron là một coumarin đơn giản nhất tồn tại trong hạt cây họ Đậu.
Cho đến nay, người ta đã biết đến gần 1000 coumarin khác nhau. Trong coumarin các nhóm OH phenol được ether hóa bằng nhóm CH3 hay bằng một
mạch tecpenoid từ 1 đến 3 đơn vị isoprenoid. về mặt hóa học, coumarin có
thể tồn tại dưới dạng tự do hay dạng kết họp với đường glucose tạo thành coumarin glycosid.
o
Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của một số coumarin
Ngoài ra còn các nhóm khác như tanin, lignin, thymol, plikatit, melanin,...
1.23. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phenolic [6].
Các họp chat phenolic thực vật có tác dụng chống lại bức xạ tia cực tím hoặc ngăn chặn các tác nhân gây bệnh, ký sinh trùng và động vật ăn thịt cũng như làm tăng các màu sắc của thực vật. Do sự phân bố rộng rãi của chúng trong hầu hết các bộ phận của cây vì thế các polyphenol đóng vai trò quan trọng đối với sức khỏe của con người nên chế độ ăn uống dinh dưỡng đã và đang được
Trường Đại học S ư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
chú ý trong nhũng năm gần đây. Các nhà nghiên cún và các nhà sản xuất thực phẩm đã tập trung vào các polyphenol có đặc tính chống oxy hóa mạnh trong chế độ ăn uống, các hiệu úng đáng tin cậy của chúng trong việc phòng ngừa nhũng chứng bệnh căng thẳng oxy hóa liên quan. Theo các nghiên cún dịch tễ học, hấp thụ các họp chất phenolic sẽ giảm được nguy cơ mắc các bệnh tim mạch ngăn ngừa được bệnh ung thư. Hơn nữa các polyphenol còn có các tác dụng sinh lý học cụ thế trong việc ngăn ngừa và điều trị bệnh.
Các hợp chất phenol như arbutin được dùng để sát trùng đường niệu, các hợp chất salycylat có tác dụng chống viêm, các ester của acid cinnamic trong actisô (như cynarin, các acid phenolic) có tác dụng bảo vệ gan. Các ester của phenylpropanoid glycosid đã được chứng minh có nhiều tác dụng quan trọng như ức chế men CAMP phosphodiesterase (forsythiasid, planta- majosid), ức chế men aldose reductase (verbacosid). Verbacosid, forsythiasid ức chế men 5-LO(5-lipoxygenase) trong bạch cầu hạt ở người và ở màng bụng chuột. Nhiều hợp chất phenol có tác dụng kháng khẩn và kháng nấm. Coumarin cũng có nhiều tác dụng dược lý quan trọng bao gồm chống đông máu, kích thích tố, làm nhạy cảm với da, diệt vi trùng, thuốc giãn mạch, diệt côn trùng, trừ giun sán, giảm đau, hạ nhiệt, làm bền và bảo vệ thành mạch như aesculetin, bergapten và fraxin. Coumarin glycosid có tác dụng chống nấm và chống ung thư. Coumarin và các dẫn xuất có khả năng kích thích đại thực bào nên có thể dùng làm thuốc điều trị vết bỏng và các vết thương do nhiệt. Ngoài ra chúng còn gây nên sự thay đổi đáng kể trong điều hòa đáp ứng miễn dịch. Chúng đóng vai trò gián tiếp qua sự điều biến của hệ miễn dịch chủ, do đó kích thích hoạt tính miễn dịch dẫn tới bảo vệ chống lại sự tái phát của khối u, hoặc giảm kích thước các khối u nhỏ và tác dụng trực tiếp ức chế phát triển đối với dòng tế bào u ác tính in vitro, thí dụ dịch chiết metanol của
thư biểu mô cuống phổi). Trong khi, tác dụng ức chế ung thư của tannin chủ yếu do khả năng kết họp của tanin với các chất gây ung thư. Tanin ở nồng độ cao ức chế hoạt động của các enzyme, nhưng ở nồng độ thấp chúng thường kích thích hoạt tính các enzyme. Tanin đóng vai trò đặc biệt trong nén ép bề mặt màng nhầy sau khi vào cơ thể, vì vậy nó dùng để trị bệnh tiêu chảy nhung phải thải trừ ngay khỏi đường tiêu hóa bằng cách dùng thuốc nhuận tràng. Ngoài ra tanin có tác dụng chống chảy máu, giảm đau và làm giảm nồng độ acid trong dạ dày. Nước ép quả hồng có chứa nhiều tannin ngưng tụ được dùng ở Nhật để điều trị cao huyết áp và ngăn ngừa chứng đột quỵ. Casuarinin,
tanin thủy phân được chiết xuất từ vỏ cây Termỉnalia arjiina Linn, có tác
dụng ức chế virus Herpes typ 2 (HSV-2) in vitro. Geraniin, một tanin thủy
phân được có trong thành phần cây chó đẻ răng cưa (Phylanthus amarus
Chum, et Thonn.) được dùng để điều trị viêm gan virus do ức chế tín hiệu điều khiến protein kinase, hay ức chế tương tác giữa HBV enhacer I và các yếu tố dịch mã tế bào. Thành phần polyphenol có tác dụng chống oxy hóa chính trong chè xanh... Lignan và các cây có chứa lignan đã được sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền, chúng có tác dụng bảo vệ gan như schizandrin,
iso schizandrin và các gomisin A, B, c, D, F và G tìm thấy trong quả cây ngũ
vị tử (Schizcindra chinensis (Turcz.) Baill., họ Ngũ vị - Schizandraceae) cho thấy tác dụng bảo vệ gan rất tốt, tăng tổng họp protein gan được dùng để điều trị viêm gan mạn có men gan tăng, điều trị tổn thương gan,... Lignan acid
nordihydroguaaretic - NDGA (trong cây Larrea mexỉcana) là một trong
những hợp chất thiên nhiên có tác dụng chống oxy hóa mạnh, ức chế men 5- LO, ức chế tế bào ung thư được dùng làm thuốc chống oxy hóa, chống ung thư và chống viêm. Nghiên cứu cho thấy Lignan và neolignan có tác dụng ức chế men, đặc biệt là men C-AMP phosphodiesterase và các men của quá trình hô hấp, chống dị ứng và viêm khóp, ức chế yếu tố hoạt hóa tiểu cầu. Một số lignan là dẫn xuất của xyclolignan naphtalenhay tetrahydro-naphtalen có tác
Trường Đại học S ư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
dụng chống virus. Từ dịch chiết chó đẻ răng cưa, các nhà khoa học Thái Lan
đã chiết được 2 dẫn xuất của lignan là phylanthin và hydrophylanthin có hoạt
tính đối với dòng tế bào ung thư KB-Vlđã kháng vinblastin. Một số lignan có thể kết hợp với protein (kể cả enzyme), polysaccharide, acid nucleic tạo các phân tử có tác dụng kháng sinh và trừ sâu bọ cho cây.
1.3. Các phưong pháp chiết mẫu thực vật.
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình...) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.
1.3.1. Chọn dung môi chiết
Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận.
Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được nhũng chất chuyến hoá thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cún), không dễ bốc cháy, không độc.
Nếu dung môi có lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết. Vì vậy những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng. Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat. Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa.
Methanol và chlorofrom thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl)- phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân
clorit và methanol là nhũng dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa...
Những tạp chất của chlorofrom như CH2C12, CH2ClBr có thể phản ứng
với một vài họp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác. Tương tự như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HC1) cũng có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất khác. Chlorofrom có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc với chất này cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát và phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chloroữom.
Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hon các hiđrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của chloroữom thấp hơn, nó có thể rủa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyến hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp. Vì vậy, khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có nhũng đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng methanol trong suốt quá trình chiết. Thí dụ trechlonolide A thu được từ trechlonaetes aciniata được chuyển thành trechlonolide B bằng quá trình phân
huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense
được chiết trong methanol nóng.
Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol.
Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ
Trường Đại học S ư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
nổ. Peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với các hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. Tiếp đến là axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit. Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trung, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo thành những sản phấm mong muốn.
Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết, tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn.
Sau khi chiết, dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30-40°C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.
1.3.2. Quá trình chiết.
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau: - Chiết ngâm.
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet. - Chiết sắc với dung môi nước.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích họp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhung hiện nay có thể
Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau.
Ví dụ:
- Khi chiết các ancaloid, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của họp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với nhũng tác nhân đặc trung như tác nhân Đragendroff và tác nhân Maye.
- Các Aavonoid thường là những hợp chất màu. Vì vậy, khi dịch chiết chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết.
- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết.
- Các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc.
Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích họp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu quả cao. Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lóp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.
Trường Đại học S ư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
1.4. Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ.
Phương pháp sắc kí (Chromatography) là một phương pháp phổ biến và