Nghiên cứu phân lập các hợp chất phenolic từ quả cây na biển (annona glabra)

Nhằm mục đích thực tập tìm hiểu cách thức chiết, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có trong thành phần hoá học của cây Na biển nên em lựa chọn đề tài khóa luận tốt ngiệp là: ‘‘N

MỞ ĐẦU

Nước ta có khí hậu và thảm thực vật khá phong phú và đa dạng Dân tộc Việt Nam có truyền thống về sử dụng các loài thảo mộc làm thuốc chữa bệnh Những năm gần đây xu hướng tìm kiếm một số hoạt chất trong các loài thảo mộc có tác dụng chữa bệnh ngày một tăng, thu hút các nhà khoa học nghiên cứu Theo các số liệu thống kê mới nhất thảm thực vật Việt Nam có trên 12000 loài, trong số đó có trên 3200 loài được sử dụng làm thuốc trong y học dân gian [1]

Từ xưa đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò hết sức quan trọng trong việc chăm sóc sức khỏe cho con người Ngày nay những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp và chăm sóc sức khỏe con người Chúng được sử dụng làm thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm… Mặc dù công nghiệp tổng hợp hóa dược ngày nay đã phát triển mạnh mẽ, tạo ra các biệt dược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh, nhờ đó giảm

tỷ lệ tử vong rất nhiều song những đóng góp của các thảo dược cũng không vì thế mà mất đi chỗ đứng trong Y học Nó vẫn tiếp tục được dùng như là nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp những chất đầu cho công nghiệp bán tổng hợp nhằm tìm kiếm những dược phẩm mới cho việc điều trị các chứng bệnh thông thường cũng như các bệnh nan y Mặt khác trong công tác phòng và chữa bệnh, Đảng và Nhà nước ta luôn chủ trương và khuyến khích sử dụng các nguyên liệu từ thực vật vì chúng có chứa nhiều biệt dược rất khó tổng hợp và hầu như không gây tác dụng phụ

Trong thế giới thực vật muôn màu, nhiều loài cây cỏ được sử dụng như

những dược liệu quý Trong số đó có cây Na biển (tên khoa học là Annona

glabra), hầu hết các bộ phận của cây đều có những tác dụng riêng, đặc biệt là

quả của cây Các dân tộc ở Trung Mỹ, Nam Mexico, Brazil và Peru sử dụng nước sắc lá cây để trị bệnh giun sán hoặc giã nát đắp mụn nhọt, áp xe và loét Theo kinh nghiệm dân gian, quả Na biển chín trị được bệnh khí hư (huyết trắng) ở phụ nữ và chứng thiếu máu Hạt giã nát dùng đắp quanh nướu răng

để làm giảm nhức răng, có tác dụng hút mủ, giải nhiệt, ban đỏ, nhuận phế, mát gan và giải khát Ngoài ra nó còn được sử dụng làm thuốc trị tiêu chảy, kiết lỵ và làm thuốc sát trùng, làm thuốc trị bướu, lá được dùng trị viêm khí quản mạn tính [2] Đây là cây thuốc quý, cần được nghiên cứu để giải thích tác dụng chữa bệnh của cây, tạo cơ sở để tìm kiếm phương thuốc điều trị bệnh

Nhằm mục đích thực tập tìm hiểu cách thức chiết, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có trong thành phần hoá học của cây Na biển nên em

lựa chọn đề tài khóa luận tốt ngiệp là: ‘‘Nghiên cứu phân lập các hợp chất

phenolic từ quả cây Na biển( Annona glabra)‘‘ với những nội dung chính

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây Na biển [2]

1.1.1 Thực vật học

Tên khoa học: Annona glabra

Tên tiếng việt: Na biển

Tên khác: Nê, bình bát nước

Họ: Mãng cầu hay họ Na (Annonaceae)

Chi: Annona

Na biển là loại cây gỗ nhỏ, cao 2 - 5m, cành ít phân nhánh, dáng giống mãng cầu xiêm Lá không lông,mọc cách; phiến lá hình bầu dục, hình trái xoan hoặc hình thuôn, cỡ 10-15  5-7 cm; chóp lá nhọn; gốc lá gần tròn; gân bên 8 - 9 đôi

Hoa phần lớn mọc đơn độc Lá đài xanh, hình tam giác; cánh hoa màu vàng, 6 cánh hoa dài 2 - 3cm, những chiếc cánh hoa vòng ngoài thường lớn và

có dạng hình tam giác rộng, cánh hoa vòng trong thường nhỏ, có bớt đỏ ở mặt trong; nhị nhiều; lá noãn nhiều; bầu có lông Quả hình trứng dài 7 - 10cm, vàng xanh, vỏ nhẵn, không gai, nạc, thịt trắng Hạt màu nâu nhạt

Hình 1.1 Cành Na biển mang quả Hình 1.2 Hoa của cây Na biển

1.1.2 Phân bố, sinh thái

Cây mọc rải rác ở các khu vực dọc bờ biển từ Quảng Ninh đến Quảng Nam (Cù Lao Chàm) và các tỉnh phía Nam Một số ý kiến cho rằng, cây Na biển có nguồn gốc ở vùng ven biển nhiệt đới Châu Mĩ và Châu Phi, được nhập trồng ở Việt Nam

Cây trồng dựa bờ rạch có nước lợ, có thể mọc cả ở dưới mương dù nước vừa phèn, vừa mặn

lỵ và làm thuốc sát trùng Vỏ cây giã ra cũng có tác dụng tương tự và dịch lá cây dùng để trừ chấy

Ở Cu Ba, gỗ bình bát nước nhẹ, được dùng làm phao giữ lưới đánh cá nổi trên mặt nước và làm thuyền đánh cá

Ở Trung Quốc, toàn cây dùng làm thuốc trị bướu, lá được dùng trị viêm khí quản mạn tính

Ngoài ra có thể trồng cây này để làm gốc ghép mãng cầu xiêm vừa tạo

ra cây mãng cầu có quả to, cơm dày, vị ngọt thanh, thích hợp với vùng trũng, đất phèn

1.1.4 Thành phần hoá học

Trong các nghiên cứu trước đây, các kết quả nghiên cứu đã công bố cho

thấy thành phần hóa học chủ yếu của cây Na biển (Annona glabra) là các

ditecpenoit (khung kauran), steroit, acetogenin

Trong thành phần hóa học của cây Na biển, các nhà khoa học đã tìm thấy 6 hợp chất diterpenoid có khung kauran đó là annoglabasin A ( metyl-

16 - axetoxy-19-al-ent-kauran-17-oate) (29) và annoglabasin B (16 -

hydro-19-axetoxy-ent-kauran-17-oic acid) (30), annoglabasin C (16

-axetoxy-ent-kauran-19-oic acid-17-metyl ester) (31), annoglabasin D (16

-axetoxy-ent-kauran-19-al-17-metyl ester) (32), annoglabasin E (16

-hydro-19-ol-ent-kauran-17-oic acid) (33), annoglabasin F (16

-axetoxy-19-nor-ent-kauran-4-ol-17-metyl ester) (34) [4, 5].

Tiếp tục điều tra thành phần hóa học của nó, các nhà khoa học đã phân lập được 28 hợp chất trong đó có 19 hợp chất diterpenoid có khung kauran (annoglabasin G (16 -hydro-19-acetoxy-ent-kauran-17-al) (1), 16 -hydro-

ent-kauran-17-oic acid (2), 16-hydro-entkauran-17-oic acid (3),

19-nor-ent-kauran-4 -ol-17-oic acid (4), 16-hydro-19-ol-ent-kauran-17-oic acid(5), ent-kaur-16-en-19-oic acid (6), 16 -hydroxy-ent-kauran-19-oic acid (7),

16 , 17-dihydroxy-entkauran-19-oic acid (8), 16

,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (9), 16 -hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid (10), 16

-hydroxy-17-acetoxy-ent-kauran-19-oic acid (11), 16

-hydro-17-hydroxy-ent-kauran-19-al(12), 16 -hydro-17-hydroxy-ent-kauran-19-al (13), 16

,17-dihydroxy-ent-kauran-19-al (14), 16-hydro-19-al-ent-kauran-17-oic acid (15), 16

-hydro-17-acetoxy-ent-kauran-19-al (16), 16

-hydro-19-acetoxy-ent-kauran-17-oic acid (17), ent-kaur-15-en-19-oic acid (18)

andent-kaur-15-en-17-ol-19-oic acid (19)), 4 hợp chất acetogenin (annomontacin (20), annonacin (21), isoannonacinone (22) và squamocin (23)), 4 hợp chấtsteroid ( -sitosterol

(24), stigmasterol (25), -sitosteryl-D-glucoside (26), glucoside (27)) và 1hợp chất oxoaporphine (liriodenine (28) [6]

stigmasteryl-D-Cấu trúc hóa học của các hợp chất này như sau:

3 4 5 6 7

8

9 10

11

12 13 14

31 COOH COOCH3 OAc

32 CHO COOCH3 OAc

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ cây Na biển

34

Trong đó, hợp chất methyl-16-hydro-19-alent-kauran-17-oate có khả năng chống lại sự nhân lên của HIV trong các tế bào lympho H9, và hợp chất

16 ,17-dihydroxy-entkauran-19-oic acid (8) cho thấy khả năng ức chế đáng

kể sự sao chép của HIV [4]

1.2 Lớp chất phenolic, thành phần hóa học có trong cây Na biển

1.2.1 Giới thiệu chung [3, 7]

Các hợp chất phenolic là các hợp chất có một hoặc nhiều vòng thơm và một hoặc nhiều nhóm hydroxyl (-OH) tự do hoặc kết hợp với các nhóm chức khác như ether, ester hoặc glycosid Các hợp chất phenolic tan trong nước vì phần lớn đều ở dạng kết hợp với đường như một glycosid và thường ở trong không bào Các hợp chất phenol có màu sắc tự nhiên nên có thể lợi dụng màu

sắc của chúng để theo dõi quá trình chiết suất và phân lập

Có hai hướng chính thơm hóa để sinh ra các phenolic thực vật:

- Hướng phổ biến nhất là đi qua Shikimate (axit Shikimic), từ các monosaccarit tạo thành các aminoaxit (Phenyl amin và Tyrosime), sau đó loại nhóm amin cho các axit Cinnamic và các dẫn xuất của chúng gồm: Axit benzoic, Acetophenone, Lignan, Lignin và Caumarin

- Con đường thứ hai là đi từ axetat và dẫn đến tạo thành các ketoester của các Polyketit dài bằng các phản ứng đóng vòng (phản ứng ngưng tụ Claisen hoặc Andol) Các sản phẩm thường là polycyclic gồm: Choromen, Isocaumarin, Orcinol, Depside, Depsidoen, Xanthone, Quinone

Poly-β-Cấu trúc đa dạng của các hợp chất phenol có được là do quá trình sinh tổng hợp và bởi sự tăng dần tần số kết hợp giữa hai con đường Shikimate và acetate đối với các hợp chất được tạo thành trong hỗn hợp Khả năng tham gia các thành tố thứ ba là hoàn toàn có thể mặc dù với tần số thấp hơn Sự kết hợp này được tạo bởi các thành tố tạo bởi hai con đường Shikimate và Mevalonate,

ví dụ như một số loại Quinone hoặc khung Furano và Poly-coumarin

Một vài hợp chất của Phenol có thể dễ dàng nhận biết bằng mắt thường như các Anthocyanin từ hoa, các hợp chất khác có thể nhận biết dưới ánh sáng đèn UV hoặc bởi các phản ứng màu đặc trưng Các phản ứng màu này được sử dụng trong quá trình sắc kí, phân lập các hợp chất Phenolic.Tuy nhiên, việc sử dụng các phản ứng màu trên các dịch chiết thường khó phát hiện và không nhạy bởi các tương tác của các yếu tố gây nhiễu kết quả thực nghiệm Các hóa chất thường được sử dụng phát hiện các chất phenol đó là: Clorit sắt, Vanllinin, Phosphomolybdate-phosphotungstate Đối với một vài hóa chất, việc sử dụng các hợp chất có cấu trúc phenol được thực hiệntheo tính đặc hiệu như thời gian phản ứng, sự chuyển màu, những điều này góp phần làm tăng khả năng nhận biết các hợp chất phenol

Chúng được phân bố rộng rãi trong giới thực vật và là các sản phẩm trao đổi chất phong phú của thực vật Hơn 8.000 cấu trúc phenolic đã được tìm thấy, từ các phân tử đơn giản như các axit phenolic đến các chất polyme như tannin, lignin, neoligman, melanin, Trong đó flavonoid là nhóm hợp chất lớn nhất nhưng là các phenol đơn vòng đơn giản, phenyl- propanoid và tất cả các quinon phenolic tồn tại tương đối nhiều [7]

Các hợp chất phenolic được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm,vì nó

có khả năng ức chế chất sinh ung thư và là chất gây đột biếnhoặc ngăn chặn các tác nhân gây bệnh, ký sinh trùng và động vật ăn thịt, cũng như làm tăng các màu sắc của thực vật Ví dụ, phenolic góp phần sự cay đắng và chát của trái cây và nước ép trái cây, vì sự tương tác giữa phenolic, chủ yếu là procyanidin, và glycoprotein trong nước bọt Anthocyan –một trong các thành phần polyphenol thực vật chịu trách nhiệm về cam, đỏ, xanh dương và màu tím của nhiều loại trái cây và rau quả như táo, dâu, củ cải và hành tây Chiết xuất phenolic hoặc polyphenol bị cô lập từ thức ăn thực vật khác nhau đã được nghiên cứu trong một số các dòng tế bào ung thư đại diện cho các giai

đoạn tiến hóa khác nhau của ung thư Ví dụ, Ross và cộng sự.cho thấy hoạt động kháng sinh chiết xuất mâm xôi trong tế bào của người bệnh ung thư cổ

tử cung (Hela) đã được chủ yếu là liên quan đến ellagitannins [9] Isoflavone genistein có trong đậu nành có thể ức chế sự tăng trưởng của các dòng tế bào ung thư khác nhau bao gồm cả bệnh bạch cầu, ung thư hạch, tuyến tiền liệt,

vú, phổi và đứng đầu là các tế bào ung thư cổ [10] Flavonoid cam quý ức chế mạnh mẽ sự phát triển của HL-60 bệnh bạch cầu tế bào [11] Ngoài ra, tác dụng chống oxy hóa và giảm đau của polyphenol đóng góp vào tác dụng điều trị dự phòng hoặc bảo vệ cơ thể Chúng có ở khắp các bộ phận của cây và vì vậy, chúng cũng là một phần không thể thiếu trong chế độ ăn uống của con người

1.2.2 Các nhóm phenolic [3, 8]

Các hợp chất phenolic có cấu trúc rất đa dạng và có thể được chia thành các nhóm chính sau:

1.2.2.1 Phenol và các acid phenolic

Phenol là các dẫn xuất benzen đơn giản nhất, ít tồn tại ở dạng tự do trong cây

Acid phenolic là các dẫn xuất của acid benzoic (C6 – C1) và acid cinamic (C6- C3)

Các phenol tự do và các acid phenolic thường cùng tồn tại trong cây, ở dạng kết hợp như một glycosid đơn giản có mặt trong phân đoạn tan trong cồn Phổ biến nhất là các acid p – hydroxybenzoic, acid procatechuic, acid vanilic,… Ngược lại với các acid trên, các phenol tự do trong cây thường tương đối hiếm Hydroquinon phổ biến nhất, ngoài ra còn gặp các catechol, orcinol,…

1.2.2.1.1 Các phenol đơn giản

Các phenol đơn giản tồn tại nhiều trong cây, hydroquinon chỉ được tìm thấy trong vài họ thực vật, chủ yếu dưới dạng glycosid diphenol hay ether monomethyl

1.2.2.1.2 Các acid phenolic: Acid phenolic bao gồm 2 nhóm:

 Dẫn xuất của acid benzoic

Các acid phenolic C6 – C1 là các dẫn xuất hydroxyl của acid benzoic tồn tại phổ biến ở trạng thái tự do, cũng như ở dạng kết hợp ester (như acid salicylic) hay glycosid; acid procatechic, acid gallic ở dạng tự do và dạng ester có trong thành phần cấu tạo của tanin và một số catechin Các andehit tương ứng với các acid này như vanilin,anisaldehyd,… cũng tồn tại tương đối phổ biến trong cây

 Các acid phenolic – dẫn xuất của acid cinamic

Hầu hết các acid phenolic C6 – C3, như acid p-coumaric, acid caffeic, ferulic,… rất phổ biến trong thiên nhiên

 Các phenol khác : như ancol phenol, aldehyd phenol (vanilin)

Hình 1.4 Cấu trúc của phenol và các acid phenolic

1.2.2.2 Flavonoid

Flavonoid là một nhóm hợp chất poliphenol đa dạng về cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học Chúng có mặt ở hầu hết các bộ phận của cây, đặc biệt trong các tế bào thực vật, là hợp chất được cấu tạo gồm hai vòng benzen A, B được kết nối bởi 1 dị vòng C với khung các bon C6-C3-C6 Tại các vòng có đính một hay nhiều nhóm hydroxy tự do hay đã thay thế một phần Vì vậy về bản chất chúng là các poliphenol có tính axit Các poliphenol có thể phản ứng lẫn nhau qua các nhóm hydroxy để tạo thành các phân tử phức tạp hơn hay có thể liên kết với các hợp chất khác trong cây như các Oza (dạng glicozit) hay protein

Các flavonoid là dẫn xuất của 2 - phenyl chroman (flavan)

3

5 6 7

8 9

Hình 1.6 Lignan

Nếu 2 nhóm (C6 – C3) liên kết với nhau bởi các liên kết khác (thí dụ 3’; 3-3’; 8-O-4’) ta được Neolignan, chẳng hạn 3 – 3’ thay cho 8 – 8’:

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của một số coumarin

Ngoài ra còn các nhóm khác như tanin, lignin, thymol, plikatit, melanin,…

1.2.3 Hoạt tính sinh học của các hợp chất phenolic [3]

Các hợp chất phenolic thực vật có tác dụng chống lại bức xạ tia cực tím hoặc ngăn chặn các tác nhân gây bệnh, ký sinh trùng và động vật ăn thịt cũng như làm tăng các màu sắc của thực vật Do sự phân bố rộng rãi của chúng trong

hầu hết các bộ phận của cây vì thế các polyphenol đóng vai trò quan trọng đối với sức khỏe của con người nên chế độ ăn uống dinh dưỡng đã và đang được chú ý trong những năm gần đây Các nhà nghiên cứu và các nhà sản xuất thực phẩm đã tập trung vào các polyphenol có đặc tính chống oxy hóa mạnh trong chế độ ăn uống, các hiệu ứng đáng tin cậy của chúng trong việc phòng ngừa những chứng bệnh căng thẳng oxy hóa liên quan Theo các nghiên cứu dịch tễ học, hấp thụ các hợp chất phenolic sẽ giảm được nguy cơ mắc các bệnh tim mạch ngăn ngừa được bệnh ung thư Hơn nữa các polyphenol còn có các tác dụng sinh lý học cụ thể trong việc ngăn ngừa và điều trị bệnh

Các hợp chất phenol như arbutin được dùng để sát trùng đường niệu, các hợp chất salycylat có tác dụng chống viêm, các ester của acid cinnamic trong actisô (như cynarin, các acid phenolic) có tác dụng bảo vệ gan Các ester của phenylpropanoid glycosid đã được chứng minh có nhiều tác dụng quan trọng như ức chế men CAMP phosphodiesterase (forsythiasid, planta- majosid), ức chế men aldose reductase (verbacosid) Verbacosid, forsythiasid

ức chế men 5-LO(5-lipoxygenase) trong bạch cầu hạt ở người và ở màng bụng chuột Nhiều hợp chất phenol có tác dụng kháng khẩn và kháng nấm Coumarin cũng có nhiều tác dụng dược lý quan trọng bao gồm chống đông máu, kích thích tố, làm nhạy cảm với da, diệt vi trùng, thuốc giãn mạch, diệt côn trùng, trừ giun sán, giảm đau, hạ nhiệt, làm bền và bảo vệ thành mạch như aesculetin, bergapten và fraxin Coumarin glycosid có tác dụng chống nấm và chống ung thư Coumarin và các dẫn xuất có khả năng kích thích đại thực bào nên có thể dùng làm thuốc điều trị vết bỏng và các vết thương do nhiệt Ngoài ra chúng còn gây nên sự thay đổi đáng kể trong điều hòa đáp ứng miễn dịch Chúng đóng vai trò gián tiếp qua sự điều biến của hệ miễn dịch chủ, do đó kích thích hoạt tính miễn dịch dẫn tới bảo vệ chống lại sự tái phát của khối u, hoặc giảm kích thước các khối u nhỏ và tác dụng trực tiếp ức chế

phát triển đối với dòng tế bào u ác tính in vitro, thí dụ dịch chiết metanol của Tordylium (chứa umbeliferon, isoimperatorin và dẫn xuất angelicin) ức chế

dòng tế bào ung thư KB (ung thư mũi hầu) và NSCLS-N6 (dòng tế bào ung thư biểu mô cuống phổi) Trong khi, tác dụng ức chế ung thư của tannin chủ yếu do khả năng kết hợp của tanin với các chất gây ung thư Tanin ở nồng độ cao ức chế hoạt động của các enzyme, nhưng ở nồng độ thấp chúng thường kích thích hoạt tính các enzyme Tanin đóng vai trò đặc biệt trong nén ép bề mặt màng nhầy sau khi vào cơ thể, vì vậy nó dùng để trị bệnh tiêu chảy nhưng phải thải trừ ngay khỏi đường tiêu hóa bằng cách dùng thuốc nhuận tràng Ngoài ra tanin có tác dụng chống chảy máu, giảm đau và làm giảm nồng độ acid trong dạ dày Nước ép quả hồng có chứa nhiều tannin ngưng tụ được dùng ở Nhật để điều trị cao huyết áp và ngăn ngừa chứng đột quỵ Casuarinin,

tanin thủy phân được chiết xuất từ vỏ cây Terminalia arjuna Linn, có tác dụng ức chế virus Herpes typ 2 (HSV-2) in vitro Geraniin, một tanin thủy phân được có trong thành phần cây chó đẻ răng cưa (Phylanthus amarus

Chum et Thonn.) được dùng để điều trị viêm gan virus do ức chế tín hiệu điều khiển protein kinase, hay ức chế tương tác giữa HBV enhacer I và các yếu tố dịch mã tế bào Thành phần polyphenol có tác dụng chống oxy hóa chính trong chè xanh… Lignan và các cây có chứa lignan đã được sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền, chúng có tác dụng bảo vệ gan như schizandrin, iso schizandrin và các gomisin A, B, C, D, F và G tìm thấy trong quả cây ngũ

vị tử (Schizandra chinensis (Turcz.) Baill., họ Ngũ vị - Schizandraceae) cho

thấy tác dụng bảo vệ gan rất tốt, tăng tổng hợp protein gan được dùng để điều trị viêm gan mạn có men gan tăng, điều trị tổn thương gan,… Lignan acid

nordihydroguaaretic – NDGA (trong cây Larrea mexicana) là một trong

những hợp chất thiên nhiên có tác dụng chống oxy hóa mạnh, ức chế men 5-

LO, ức chế tế bào ung thư được dùng làm thuốc chống oxy hóa, chống ung

thư và chống viêm Nghiên cứu cho thấy Lignan và neolignan có tác dụng ức chế men, đặc biệt là men C-AMP phosphodiesterase và các men của quá trình

hô hấp, chống dị ứng và viêm khớp, ức chế yếu tố hoạt hóa tiểu cầu Một số lignan là dẫn xuất của xyclolignan naphtalenhay tetrahydro-naphtalen có tác dụng chống virus Từ dịch chiết chó đẻ răng cưa, các nhà khoa học Thái Lan

đã chiết được 2 dẫn xuất của lignan là phylanthin và hydrophylanthin có hoạt tính đối với dòng tế bào ung thư KB-V1đã kháng vinblastin Một số lignan có thể kết hợp với protein (kể cả enzyme), polysaccharide, acid nucleic tạo các phân tử có tác dụng kháng sinh và trừ sâu bọ cho cây

1.3 Các phương pháp chiết mẫu thực vật

Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất

có trong các mẫu khác nhau (chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình, chất phân cực…) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

1.3.1 Chọn dung môi chiết

Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc

Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau.Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm Dung môi dùng trong quá trình chiết ít khi được quan tâm và cần phải được lựa chọn rất cẩn thận

Dung môi nếu lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết Vì vậy những dung môi này cần được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng Có một số chất dẻo thường lẫn trong dung môi như: diankyl phtalat, tri-n-butyl photsphat và tri-n-butyl axetylcitrar Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất

hoặc trong khâu bảo quản như trong các nút đậy bằng nhựa hoặc trong các thùng chứa

Metanol và clorofoc thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl) phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Clorofoc, metyl clorit

và metanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ

bộ một phần của cây như: Rễ, thân, lá, hoa, củ, quả…

Những tạp chất của clorofoc như CH2ClBr, CH2Cl2 có thể phản ứng với vài hợp chất như các ancaloid tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác Tương tự như vậy, sự có mặt của một lượng nhỏ axit clohidric (HCl) cũng có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất khác Clorofoc có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc với chất này cần thao tác cẩn thận và khéo léo ở nơi thoáng mát và phải đeo mặt

nạ phòng độc Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn clorofoc

Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hidrocacbon thế clo Các dung môi thuộc nhóm rượu được cho rằng sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào Trái lại, khả năng phân cực của clorofoc thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hoà tan đồng thời Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ

Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm được tạo thành khi dùng methanol trong suốt quá trình chiết Thí dụ trechlonolide A thu được từ trechonaetes aciniata được chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân huỷ 1-

hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được chiết trong metanol nóng

Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nước của metanol

Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất

dễ bay hơi, dễ bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ nổ, peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với những hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các calotenoid Tiếp đến là axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit – bazơ có thể tạo thành những sản phẩm mong muốn

Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết tránh được sự phân huỷ của chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn

Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30-400C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

1.3.2 Quá trình chiết

Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

- Chiết ngâm

- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet

- Chiết sắc với dung môi nước

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy

để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi Dung môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả cao hơn Trước đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thuỷ tinh

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng

24 giờ rồi chất chiết được lấy ra Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau

Ví dụ: Khi chiết các ancaloid, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân: Dragendroff và Maye

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy

để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi Dung môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả cao hơn Trước đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thuỷ tinh

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng

24 giờ rồi chất chiết được lấy ra Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau

Ví dụ: Khi chiết các ancaloid, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân: Dragendroff và Maye

1.4 Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ

Phương pháp sắc ký (Chromatography) là một phương pháp phổ biến

và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng

1.4.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký

Sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha động và pha tĩnh

Sắc ký gồm có pha động và pha tĩnh Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan…) Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá tình hấp phụ và phản hấp phụ Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha này, nhờ đặc điểm này người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký

1.4.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha tĩnh và pha động Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:

n = Error!

Trong đó: n: lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

n∞: lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chấthấp phụ nào đó

b: hằng số C: nồng độ của chất bị hấp phụ

1.4.3 Phân loại các phương pháp sắc ký

Trong phương pháp sắc ký, pha động là các lưu thế (các chất ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký lỏng và sắc ký khí Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia ra thành các phương pháp sắc ký chủ yếu sau:

1.4.3.1 Sắc ký cột (C.C)

Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh) Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm Trong một số trường hợp, nếu lực trọng trường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao (HPLC)

Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể Trong sắc ký, tỷ lệ giữa đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi là Rf, với mỗi một chất sẽ

có một Rf khác nhau Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng

chất ra khỏi hỗn hợp Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng

và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách Nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 - 1/10), còn nếu tách tinh thì tỷ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 - 1/30

Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng Tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột Nếu tách tinh thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

- Cách 1: Nhồi cột khô Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt

- Cách 2: Nhồi cột ướt Tức là chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu Sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết

Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách) và cột không được nứt, gãy

Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách Nếu tốc

độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm tốc độ hiệu quả tách Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc

1.4.3.2 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử đụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica

gel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng sẵn silica gel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc ký, người ta có thể cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2 SO 4 10%

1.5 Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ

Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phương pháp phổ kết hợp Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà người ta

sử dụng phương pháp phổ cụ thể nào Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, kết hợp với các phương pháp sắc ký so sánh…

1.5.1 Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, IR)

Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Do đó dựa vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm đặc trưng trong hợp chất

Ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300-3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C=O trong khoảng 1700-1750 cm-1

1.5.2 Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy, MS)

Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân