Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hoá học của một số hợp chất dibenzocyclooctadiên lignan từ cây na rừng (kadsura coccinea)

Phạm Thị Thu Thủy Lớp K31B – Khoa Hóa Học 19 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan các kết quả trong khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất d

Trang 1

Phạm Thị Thu Thủy Lớp K31B – Khoa Hóa Học 16

Khóa luận tốt nghiệp đại học

Chuyên ngành: hóa hữu cơ

Hà nội – 2009

Trang 2

Khóa luận tốt nghiệp đại học

Chuyên ngành: hóa hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học

T.S Nguyễn văn bằng

Hà nội – 2009

Trang 3

Lời cảm ơn Khóa luận tốt nghiệp này được thực hiện tại phòng xúc tác hữu cơ, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới thầy giáo

– TS Nguyễn Văn Bằng, Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình, tận

tâm hướng dẫn em trong quá trình thực hiện khóa luận này

Em xin trân trọng cảm ơn và bày tỏ lòng kính trọng trước sự giúp đỡ tận

tình của thầy giáo – TS Phan Văn Kiệm, Viện hóa học các hợp chất thiên

nhiên, Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam

Qua đây em cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô giáo trong bộ môn Hóa hữu cơ, Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 và các cán bộ công nhân viên phòng xúc tác hữu cơ, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã ủng hộ và tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Mặc dù bản thân em đã cố gắng nỗ lực rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận và được sự quan tâm, hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo nhiệt tình của các thầy cô giáo nhưng khoá luận vẫn còn nhiều hạn chế, thiếu sót Vì vậy em kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo của các thầy cô giáo và các bạn sinh viên quan tâm

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2009

Sinh Viên

Phạm Thị Thu Thủy

Trang 4

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan các kết quả trong khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất dibenzocyclooctadiene lignan từ cây Na rừng (kadsura Coccinea)” là của tôi

thực hiện, không sao chép của bất kỳ một đề tài nào đã công bố trước đây

Trang 5

1.1.4 Những nghiên cứu sơ bộ về cây Na rừng 4

1.2 Các phương pháp chiết mẫu thực vật 5

Trang 6

3.1 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1 -

Trang 7

Danh mục những chữ viết tắt

[ỏ]D Độ quay cực ( Specific Optical Botation)

13

C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

( Cacbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

1

H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

( Proton Magnetic Resonance Spectroscopy) 2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều

Two – Pimensional NMR

TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

DEPT Distortionless Enhacement By Polarisation Trafer

MS Phổ khối lượng (Mass Spectranetry)

EI-MS Electron Ionization Mass Spectranetry

EIS – MS Phổ khối lượng phun mù điện tử

Electron Spray Ionization Mass Spectranetry FAB – MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh

Fast Atom Bombardment Mass Spectranetry HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivily

HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

Trang 8

Danh mục các sơ đồ, hình và bảng biểu

Trang

Sơ đồ 2.5.a Sơ đồ chiết xuất và phân lớp các hợp chất 19

Sơ đồ 2.5.b Sơ đồ tách phân đoạn cặn KC1 và tinh sạch hợp chất

Trang 9

Mở đầu

Các sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên hay nguồn tài nguyên sinh học ngày càng được con người quan tâm, sử dụng rộng rãi trong các ngành kinh tế quốc dân bởi đặc tính ít độc, dễ hấp thụ, không làm tổn hại đến môi sinh và đặc biệt là nếu sử dụng hợp lý chúng ta có thể làm phong phú thêm về số lượng và chất lượng để phục vụ con người Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học được sử dụng làm thuốc chữa bệnh cho con người, vật nuôi, thuốc bảo vệ thực vật, chất kích thích, điều hòa sinh trưởng động, thực vật và làm nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm, hóa mỹ phẩm

Theo các tài liệu công bố hiện nay có khoảng 60 – 70% các loại thuốc chữa bệnh đang được lưu hành hoặc trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc từ thiên nhiên [10]

Nước Việt Nam chúng ta nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm, lượng mưa lớn, đó là điều kiện vô cùng thuận lợi cho sự phát triển của các loài sinh vật Do đó nước ta có nguồn tài nguyên sinh vật rất đa dạng và phong phú đặc biệt là tài nguyên rừng Rừng Việt Nam có thảm thực vật phong phú vào loại bậc nhất trên thế giới với khoảng 12.000 loài, trong đó 4.000 loài được nhân dân sử dụng làm thảo dược cùng các mục đích khác phục vụ cuộc sống con người [1] Đó là một nguồn tài nguyên dược liệu vô cùng quý giá và là tiền đề cho sự phát triển ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên ở nước ta để phục vụ con người trong đời sống lao động và sản xuất

Cùng với bề dày hơn 4000 năm lịch sử, ngành Đông y của nước ta đã thu được những thành tựu rực rỡ: nhiều phương thuốc từ cây cỏ, động vật được ứng dụng hiệu quả và lưu truyền đến ngày nay Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ nói chung và y học nói riêng, y học cổ truyền cùng với y học hiện đại

đã và đang có những đóng góp to lớn, góp phần vào việc phòng, chữa bệnh và

Trang 10

làm tăng tuổi thọ cho con người Vấn đề đặt ra hiện nay là làm như thế nào để khai thác và sử dụng hợp lí nguồn tài nguyên thiên nhiên đem lại hiệu quả cho

xã hội

Rễ cây Na rừng được sử dụng làm thuốc từ lâu đời, ngoài ra người ta còn

sử dụng các sản phẩm khác của nó vì cây có hoạt tính sinh học cao, chứa nhiều thành phần hóa học và có nhiều tác dụng dược lý Song chưa hề có tài liệu nào công bố về thành phần hoá học của cây Na rừng một cách đầy đủ, chính xác Việc nghiên cứu, khảo sát thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây Na rừng ở Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng một cách hiệu quả, hợp lý có ý nghĩa quan trọng đặc biệt đối với sự phát triển của nền y học Việt Nam hiện đại dựa trên các phương thuốc cổ truyền Xuất phát từ ý

nghĩa thực tiễn trên em chọn nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất dibenzocyclooctadiene lignan từ cây na rừng (Kadsura Coccinea)”

Nhiệm vụ của khóa luận

1 Phân lập một số hợp chất dibenzocyclooctadiene lignan từ cây na rừng

2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp phổ

Trang 11

CHƯƠNG 1: Tổng quan

1.1 Tổng quan về cây Na rừng [1], [2]

1.1.1 Thực vật học:

Cây Na rừng có tên trong dân gian là Dây xưn xe, Nắm cơm, Ngũ vị nam

và tên khoa học là Kadsura Coccinea (Tên khác là Kasura sinensis hace hay Schizadra hanceana baill), thuộc họ ngũ vị - Schisandraceae Cây Na rừng là loại cây dây leo to có nhánh mọc trườn, mảnh, phủ lớp lông tuyết màu sậm rồi về sau

có lỗ bì hình dải Lá bầu dục hay thuôn, dạng góc ở gốc, thon hẹp, tù dài 10cm, rộng 3-4cm nhạt màu ở dưới, rất nhhẵn Hoa đơn tính ở nách lá dài 15mm, rộng 10mm, màu tía Quả giống như một nắm cơm (nên được gọi là cây Nắm cơm) hay giống một quả Na to Hoa Na rừng có vào tháng 5-6, quả có vào tháng 8-9

6-Hình 1.1 Cây Na rừng (Kadsura Coccinea)

Trang 12

1.1.4 Những nghiên cứu sơ bộ về cây Na rừng:

Trong cây Na rừng có chất nhầy trong thân và quả Trong quả còn có pectin, glucoza, tinh dầu, axit hữu cơ, protit và chất béo

- Phong thấp đau xương, đòn ngã ứ đau

- Đau bụng trước khi hành kinh, sản hậu ứ đau sưng vú

Liều dùng: 15 – 30 gam rễ khô, sắc nước uống

Dân gian cũng thường dùng vỏ thân, vỏ rễ làm thuốc bổ kích thích tiêu hóa, giảm đau Ngày dùng 8 – 16 gam sắc nước hoặc ngâm rượu uống

Cây Na rừng với thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cao góp phần tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm những phương thuốc mới, cũng như hiểu rõ hơn về tác dụng chữa bệnh của cây thuốc cổ truyền dân tộc mà cha ông ta đã từng sử dụng

Trang 13

1.2 Các phương pháp chiết mẫu thực vật [4], [5]

Sau khi tiến hành thu hái và sấy mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất có trong mẫu khác nhau (chất không phân cực, chất có độ phân cực vừa phải,…)

mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

1.2.1 Chọn dung môi chiết

Thường thì các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau Đôi khi để tạo ra độ phân cực của dung môi thích hợp người ta không chỉ dùng đơn thuần một loại dung môi mà phối hợp một tỷ lệ nhất định để tạo ra hệ thống dung môi mới Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít được quan tâm Dung môi dùng cho quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận Nó cần hòa tan những chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ,

có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi

sử dụng, nếu chúng có lẫn các chất khác có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylnirat và tributylphotphat Những chất này

có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất dung môi hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa bằng nhựa hoặc các nút nhựa

Metanol và clorofooc thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl) phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hóa thực vật Chất này còn thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Clorofoc, metylen clorua

và metanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây (như lá, thân, rễ, củ, hoa, quả…)

Những tạp chất của clorofooc như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng với một vài hợp chất như ankaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác Tương

Trang 14

tự như vậy sự có mặt của một lượng nhỏ axit clohidric (HCl) cũng có thể gây ra

sự phân hủy, sự khử nước hay sự đồng phân hóa các hợp chất khác Bởi vì clorofooc có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thông thoáng và phải đeo bảo hộ lao động Metylen clorua ít độc hơn và dễ bay hơi hơn clorofooc

Metanol và các etnaol 80% là những dung môi phân cực hơn các hidrocacbon thế clo Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào

Trái lại, clorofooc khả năng phân cực tốt thấp hơn, có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Các ancol hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hòa tan đồng thời Thông thường dung môi ancol trong nước dường như có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ

Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng metanol trong suốt quá trình chiết Ví dụ trechlonolide A thu được từ

Trechonaetes lacciniata được chuyển thành trechlonolide B bằng các quá trình

metyl hóa khi đun nóng với metanol chứa một ít axit, quá trình phân hủy hydroxytropacocain cũng xảy ra khi Erythroxylum novogranatense được chiết trong metanol nóng

1-Người ta thường ít khi sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nước của metanol

Dietyl ete hiếm khi được dùng cho quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, dễ bộc cháy và độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peoxit dễ nổ, peroxit của dietylete dễ gây phản ứng oxi hóa với những hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid Tiếp đến là axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit Quá trình chiết

Trang 15

dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tác đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo ra những sản phẩm mong muốn

Sự hiểu biết về các đặc tính của những chất chuyển hóa thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết tránh được sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn.Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30 – 400C, với một vài hóa chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

1.2.2 Quá trình chiết

Hầu hết các quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

- Chiết ngâm

- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet

- Chiết sắc với dung môi nước

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rỗng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian Thiết bị sử dụng là một bình thủy tinh với một cái khóa ở dưới đáy để tạo tốc độ chảy cho quá trình tách rửa dung môi Dung môi có thể nóng hoặc lạnh Trước kia các máy chiết ngâm đòi hỏi phải bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thủy tinh

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ và sau đó chất chiết được lấy ra Cần lưu ý sau một quá trình chiết 3 lần dung môi, cặn thu được sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa Sự kết thúc quá trình quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau Bởi vì khi chiết các ankaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của nhiều hợp chất này ra khỏi

Trang 16

bình chiết bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân Dragendorff và tác nhân Mayer Cũng vậy, các flavoloid thường là những hợp chất màu và bởi vậy khi dịch chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu là rửa hết những chất này trong quá trình chiết khi chiết các chất béo, nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn tiếp sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết Trong trường hợp các lacton của secquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng kedde có thể được sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với anilin axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydratcacbon, và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc

Như vậy tùy thuộc mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu quả cao Ngoài

ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta

có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết

1.3 Các phương pháp sắc ký [3]

Phương pháp tách chất bằng sắc ký được bắt đầu từ năm 1903 Năm 1903 nhà bác học người Nga Txvet đã dùng cột nhôm ôxit để tách các picmem của lá cây thành các chất riêng biệt Ông đã giải thích hiện tượng này bằng ái lực hấp phụ khác nhau của các sắc tố và đặt tên là phương pháp sắc ký (chromatography) Phương pháp sắc ký là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay được sử dụng để phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng

Sắc ký bao gồm có pha tĩnh và pha động Trên thế giới hiện nay phổ biến

sử dụng pha tĩnh là chất rắn (bao gồm các loại chất hấp phụ như: silicagel, YMC, ODS, Al2O3,…) còn pha động được sử dụng là chất lỏng (sắc ký lỏng) hay chất khí (sắc ký khí) Pha động được dùng trong sắc ký lỏng là các dung môi hữu cơ, trên nguyên tắc là chất phân cực hơn sẽ tan tốt trong dung môi phân cực hơn, và ngược lại chất ít phân cực hơn sẽ tan tốt hơn trong dung môi kém phân

Trang 17

cực hơn Có thể sắp xếp độ phân cực của dung môi theo dãy tăng dần độ phân cực của dung môi như sau: ete dầu hỏa, xiclohexan, cacbontetraclorua, xylen, toluen, benzen, clorofom, metylen clorua, axeton, dioxan, etylaxetat, piridin, propanol, metanol, axit axetic

Nguyên tắc căn bản được sử dụng trong phương pháp này là dựa vào sự khác nhau về ái lực giữa các chất cần tách với chất hấp phụ Độ phân cực của dung môi tăng dần từ ete dầu hỏa đến nước Tùy thuộc vào cách tiến hành sắc ký

mà người ta chia thành các phương pháp sắc ký chủ yếu như sau:

1.3.1 Sắc ký cột (CC)

Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh bao gồm các loại silica gel (độ hạt khác nhau) pha thường cũng như pha đảo YMC, ODS, dianion, …Chất hấp phụ được nhồi vào cột (có thể cột thủy tinh hay cột bằng kim loại inox, nhưng phổ biến nhất là cột thủy tinh) Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng , nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao, và ngược lại Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm Trong một số trường hợp nếu lực trọng trường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao (HPLC)

Trong sắc kí cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng,

nó thể hiện khả năng tách của cột Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể Trong sắc kí, tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách

so với quãng đường đi của dung môi gọi là Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau Chính nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp chất

Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách Nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp (từ 1/5 – 1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và

Trang 18

tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau về Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20-1/30

Trong sắc kí cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng Tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương

pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến là tẩm chất vào

silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột Nếu tách tinh, thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

- Cách 1: Nhồi cột khô Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt

- Cách 2: Nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu Sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết

Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), và cột không được nứt, gẫy, dò

Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc

1.3.2 Sắc kí lớp mỏng

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định

hướng cho sắc kí cột SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel

trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng silica gel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản, và sau khi chạy sắc kí, người ta

Trang 19

có thể cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc

sánh…

1.4.1 Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR)

Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Chính vì vậy, việc phân tích phổ hồng ngoại là nhằm chỉ rõ nguồn gốc các vân hấp phụ cơ bản trên phổ, từ đó cho biết các nhóm nguyên tử trong phân tử (đặc biệt là nhóm chức)

và rút ra những kết luận về cấu trúc phân tử, ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300-3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C=O trong khoảng 1700-1750 cm-1, của nhóm ete C-O-C trong vùng 1020-1100 cm-1, của nhóm C=C trong khoảng 1630-1650 cm-1, của nhóm N-H trong khoảng 3400-3500 cm-1, v.v… Đặc biệt vùng dưới 700 cm-1

được gọi là vùng vân tay được sử dụng để nhận dạng các hợp chất hữu cơ theo phương pháp

so sánh trực tiếp Hiện nay thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều, mặc dù vậy lượng chất cần để thực hiện phép đo phổ này (nghiền và ép

Trang 20

viên với KBr bằng máy ép thủy lực dưới áp suất thấp khoảng 13-15 atm) lại cần

từ 2-3 mg và khó thu hồi lại Chính vì vậy, thông thường đối với các hợp chất thiên nhiên (lượng chất thu được ít) thì phổ hồng ngoại được đo sau khi đã hoàn chỉnh các phép đo khác như phổ cộng hưởng từ hạt nhân

1.4.2 Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS)

Nói một cách đơn giản máy phổ khối lượng được chế tạo để thực hiện ba nhiệm vụ cơ bản là: chuyển chất nghiên cứu thành thể khí; tạo ra các ion phân tử

và ion mảnh từ khí đó; phân tách các ion đó rồi ghi lại tín hiệu theo tỷ số khối lượng trên điện tích (m/ze) của chúng Bởi vì e là điện tích của một electron, được lấy là 1, nên các ion có z >1 là rất nhỏ, do đó tỷ số m/ze thường chính là khối lượng của ion Vì thế phổ thu được có tên là phổ khối khối lượng viết tắt là

phổ MS (Mass Spectroscopy)

Phổ khối lượng được sử dụng khá phổ biến để xác định cấu trúc hóa học

của các hợp chất hữu cơ Nguyên tắc chủ yếu của phương pháp phổ này là dựa

vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Ngoài ion phân tử, phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người

ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học các

hợp chất Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, những phương pháp chủ

yếu được nêu ra dưới đây:

+ Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) dựa vào sự

phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV

+ Phổ ESI-MS (Electron Spray Ionization mass spectroscopy) gọi là phổ

phun mù điện tử Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn pha thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các píc đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ

Trang 21

+ Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phổ bắn phá

nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử

+ Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy),

cho phép xác định píc ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao

Ngoài ra, hiện nay ngưòi ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc kí kết hợp với khối phổ khác như: GC-MS (sắc kí khí -khối phổ), LC-MS (sắc kí lỏng-khối phổ) Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành

phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược)

1.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu

nhất hiện nay được dùng để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ nói riêng và hợp chất thiên nhiên nói chung Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử

Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon)

là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1

H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ chuyển dịch hoá học (chemical shift) Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác

định dựa vào tương tác spin-spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling)

a) Phổ 1H-NMR (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton: Proton Magnetic Resonance Spectroscopy)

Trong phổ 1

H-NMR, độ chuyển dịch hoá học (ọ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần Dựa vào những đặc trưng của độ

Trang 22

chuyển dịch hoá học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất

chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH

d) Phổ 2D-NMR (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều Two – Pimensional NMR)

Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều Một số kỹ thuật chủ yếu thường được

sử dụng như sau:

+ Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence):

Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR Các tương tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ

+Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) (1 H- 1 H Chemical Shift Correlation Spectroscopy):

Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H- H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau

Trang 23

+ Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity):

Đây là phổ biểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc

+ Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy):

Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử

Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE differences

để xác định cấu trúc không gian của phân tử Bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía

về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu với cường độ mạnh hơn

Ngày nay người ta còn sử dụng nhiều kỹ thuật phổ hai chiều rất hiện đại khác ví dụ như kỹ thuật xóa tương tác trên các phổ nhất định (decouplng), ví dụ như trên phổ proton, xóa tương tác của một proton nào đó xác định có thể xác định được vị trí của các proton bên cạnh,…

Ngoài ra, còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơngen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể Phạm vi sử dụng của phổ này rất hạn chế vì yêu cầu tiên quyết là phải có đơn tinh thể Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu cơ

Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người còn sử dụng

kết hợp với các chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp phân tích so

sánh kết hợp khác Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều khó xác định chính xác được chiều dài các mạch, cũng như đối với các phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định chính xác các loại đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương

Trang 24

Phạm Thị Thu Thủy Lớp K31B – Khoa Hóa Học 39 pháp thủy phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh bằng LC-MS hoặc GC-

MS với các đường chuẩn dự kiến

Trang 25

Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

2.2.3 Phổ khối lượng (FAB-MS và ESI)

Phổ khối lượng FAB-MS được đo trên máy JEOL JMS-DX 300 spectrometer của Viện nghiên cứu Khoa học cơ bản Hàn Quốc (KBSI) Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Trang 26

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1

H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa

học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

+ Máy cất quay chân không

+ Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 368 nm

+ Tủ sấy chân không

+ Máy sấy

+ Micropipet

+ Bình sắc ký loại phân tích và điều chế

+ Cột sắc ký pha thường các loại đường kính

+ Cột sắc ký pha đảo trung áp

+ Máy phun dung dịch thuốc thử

+ Bếp điện

2.3.2 Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc

+ Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR AM500 FT-NMR Spectrometer + Máy sắc ký lỏng cao áp ghép nối khối phổ (ESI) AGILENT 1100 LC-MSD Trap Spectrometer

+ Thiết bị đo điểm nóng chảy Kofler micro-hotstage

Định dạng
Số trang	53
Dung lượng	1,97 MB

Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hoá học của một số hợp chất dibenzocyclooctadiên lignan từ cây na rừng (kadsura coccinea)

Thực nghiệm và phƣơng pháp nghiên cứu