Mục tiêu nghiên cứu nhằm phân lập, tinh khiết hóa và xác định cấu trúc hóa học của chất có hoạt tính kháng vi sinh vật từ cao toàn phần thân rễ và rễ ngải bún. Thân rễ và rễ ngải bún thu mua tại thị trấn Trà Cú, tỉnh Trà Vinh vào tháng 10/2016.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HOẠT CHẤT KHÁNG VI SINH VẬT CÓ TRONG CAO CHIẾT THÂN RỄ VÀ RỄ NGẢI BÚN (BOESENBERGIA PANDURATA (ROXB.) SCHLTR ZINGIBERACEAE) Phạm Bền Chí*, Nguyễn Đinh Nga* TĨM TẮT Mở đầu: Boesenbergia pandurata Zingiberaceae dược liệu Việt Nam biết đến với tên Ngải bún Thân rễ rễ Ngải bún sử dụng dân gian để hỗ trợ điều trị bệnh nhiễm khuẩn nhiễm nấm Mục tiêu: Phân lập, tinh khiết hóa xác định cấu trúc hóa học chất có hoạt tính kháng vi sinh vật từ cao toàn phần thân rễ rễ Ngải bún Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Thân rễ rễ Ngải bún thu mua thị trấn Trà Cú, tỉnh Trà Vinh vào tháng 10/2016 Cao thân rễ rễ Ngải bún (Cao NB): Bột thân rễ rễ Ngải bún ngâm lạnh với cồn 96% 24 Sau bốc dung môi, cao cồn lắc phân bố tỉ lệ 1:1 với với dung môi n – hexan, dichloromethan, ethylacetat để thu cao phân đoạn (PĐ) Hoạt tính kháng vi sinh vật cao toàn phần cao phân đoạn thực theo phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy pha lỗng mơi trường rắn Sử dụng sắc ký cột cổ điển với hỗ trợ sắc ký lớp mỏng, kỹ thuật hình sinh học để phân lập hoạt chất kháng vi sinh vật từ cao NB Kiểm tra độ tinh khiết UPLC xác định cấu trúc hóa học hoạt chất kháng vi sinh vật cao NB phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Kết bàn luận: Cao NB cao phân đoạn cho hoạt tính kháng mạnh chủng nấm da Microsporum gypseum, Trichophyton rubrum Trichophyton mentagrophytes (MIC từ 90 – 120 µg/ml); kháng vừa S aureus MRSA (MIC từ 1100 – 1500 µg/ml) Đã phân lập xác định hoạt chất kháng vi sinh vật có cao NB pinocembrin Kết phù hợp với nghiên cứu trước Từ khóa: Thân rễ rễ Ngải bún, kháng khuẩn, kháng nấm, pinocembrin ABSTRACT ISOLATING AND DETERMINING CHEMICAL STRUCTURE OF ANTI MICROORGANISM SUBSTANCE FROM EXTRACT OF NGAI BUN RHIZOME AND ROOTS (BOESENBERGIA PANDURATA (ROXB.) SCHLTR ZINGIBERACEAE) Pham Ben Chi, Nguyen Dinh Nga * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018: 469 - 474 Background – Objectives: B pandurata is one of the herbals in Viet Nam and is known as “Ngai bun” Its rhizome and roots have been traditionally used in treatment infections The aim of the study to isolating, purifying and determining the chemical structure of antimicroorganism agent from the its extract Material and methods: The rhizome and roots of B pandurata was collected in Tra Cu town, Tra Vinh province in 10/2016 Its powder was extracted with 96% EtOH for 24 hours This extract was partitioned with n – hexane, DCM and EtOAc The antimicroorganism activity of these extracts were evaluated by applying disk *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS TS Nguyễn Đinh Nga ĐT: 0908836969 Email: nganguyendinh@ump.edu.vn Chuyên Đề Dƣợc 469 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 diffusion and agar dilution methods The antimicroorganism agent was isolated, purified by column chromatography in support with layer chromatography (TLC) and autobiography method Its purify was tested by UPLC method Its chemical structure was determined by NMR spectrum Results: The EtOH, DCM and EtOAc extracts strongly effect against T mentagrophytes, T rubrum and M gypseum with MIC values from 90 – 120 µg/ml, and have medium active on S aureus and MRSA with MIC values from 1100 – 1500 µg/ml The antimicroorganism agent was determined as pinocembrine Conclusion: The results demonstrated the strong potential of the extracts of B pandurata for pharmaceutical development Keyword: Boesenbergia pandurata, rhizome and roots, antimicrobial, antifungal, pinocembrine rubrum, Microsporum gypseum, Malassezia furfur ĐẶT VẤN ĐỀ ATCC 44344, Candida albicans ATCC 10231 Nhiễm khuẫn, nhiễm nấm ảnh hưởng nhiều Phƣơng pháp nghiên cứu đến chất lượng sống người Các Chiết xuất: Bột thân rễ rễ Ngải bún nhà khoa học giới liên tục tìm kiếm chiết phương pháp ngâm lạnh với ethanol hợp chất từ nguyên liệu có nguồn gốc 96% (EtOH) lần với tỷ lệ dược liệu: dung môi tổng hợp tự nhiên để bổ sung nguồn hợp chất (1:10, 1:7,5 1:5) 24 Dịch chiết ethanol kháng vi sinh vật đối phó với tượng bay dung mơi đến khoảng 1/10 thể kháng thuốc vi sinh vật Với điều kiện khoa tích ban đầu (cao NB) Sau lắc phân bố dịch học kỹ thuật hạn chế, việc phát triển nguồn chiết với n – hexan, dichloromethan (DCM), nguyên liệu hóa dược Việt Nam gặp nhiều ethylacetat (EtOAc) với tỷ lệ 1:1, bốc dung thách thức Bên cạnh Việt Nam có nguồn tài mơi để thu cao phân đoạn nguyên thiên nhiên phong phú với nhiều dược liệu có tiềm chưa khai thác nhiều Từ lâu, dược liệu thuộc họ Gừng – Ngải bún (Boesenbergia pandurata Zingiberaceae) dân gian sử dụng để làm gia vị chữa số bệnh chốc lở, kháng viêm, đầy bụng, giun sán, ung thư < chưa chứng minh chứng khoa học Việt Nam(2) Chính vậy, mục tiêu nghiên cứu chứng minh hoạt tính kháng vi sinh vật thân rễ rễ Ngải bún VẬT LIỆU –PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Nguyên liệu Thân rễ rễ Ngải bún thu mua thị trấn Trà Cú, tỉnh Trà Vinh vào tháng 10/2016; định danh cách khảo sát đặc điểm hình thái, giải phẫu thực vật so sánh với tài liệu tham khảo(8) Vi khuẩn thử nghiệm: Staphylococus aureus ATCC 29213, MRSA ATCC 43300, E Coli ATCC 25922, Pseudomonas aegrunosa ATCC 27853 Vi nấm thử nghiệm: Trichophyton mentagrophytes, T 470 Phân lập hoạt chất kháng vi sinh vật có cao NB Kỹ thuật hình sinh học với kết hợp sắc ký lớp mỏng xác định tác động kháng vi sinh vật hợp chất phân tách bảng mỏng sắc ký Điều kiện thực hiện: Cao NB hòa tan CHCl3 chấm lên mỏng silicagel F254 (Merck); khai triển với pha động: CHCl3 – EtOAc (9:1); phát vết cách soi UV bước sóng 254 nm 365 nm; vi sinh vật thử nghiệm: M gypseum S aureus.(3) Cao NB sử dụng để phân lập hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật sắc ký cột cổ điển với điều kiện sắc ký: Cột 50 cm x cm; pha tĩnh: 70 g silica gel cỡ 37 – 63 µm; pha động: CHCl3 – EtOAc (9:1) (Cột 1), nhexan – EtOAc (5:2) (Cột 2); thể tích phân đoạn ml, lượng mẫu nạp g Gộp phân đoạn có vết tương tự sắc ký lớp mỏng, khảo sát tác động kháng vi sinh vật kỹ thuật hình sinh học Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Chất phân lập xác định độ tinh khiết UPLC với điều kiện: máy UPLC hãng Water; cột C18 Sunfire 4,6 x 150 mm, kích thước hạt pha tĩnh µm; pha động: nước – acetonitril; chương trình chạy gradient (nước từ 90% đến 10%); thể tích tiêm mẫu µl; tốc độ dòng 0,8 ml/phút; đầu dò PDA phát bước sóng 288,7 nm; thời gian chạy 55 phút Xác định cấu trúc hoạt chất kháng vi sinh vật cao NB phổ NMR Tác động kháng vi sinh vật cao NB cao phân đoạn Ngải bún xác định phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy phương pháp pha lỗng mơi trường rắn theo hướng dẫn CLSI M38 – A2 Môi trường Nghiên cứu Y học sử dụng TSA cho vi khuẩn, SDA cho nấm da C albicans, m – Dixon cho M furfur.(7) KẾT QUẢ Chiết xuất Từ 500 g bột Ngải bún khô (thu từ kg thân rễ rễ Ngải bún tươi), sau ngâm lạnh với EtOH 96% thu 66,64 g cao toàn phần NB Từ 50 g cao toàn phần, sau lắc phân bố với dung môi thu cao n – hexan (17,25 g), DCM (23,75 g), EtOAc (2,13 g) cao nước lại (2,13 g) Hoạt tính kháng vi sinh vật cao toàn phần cao phân đoạn từ ngải bún Bảng 1: Đường kính vòng ức chế vi sinh vật cao NB cao PĐ (mm) Cao TP NH DCM EtOAc Nƣớc Lượng cao đĩa giấy (mg) 0,82 0,95 0,80 0,94 0,85 Chứng âm Sa 11,33 10,67 10,83 - Vi khuẩn MRSA Pa 10.50 10,17 10,33 - Ec - Tm 17,50 18,33 19,17 - Tr 19,17 20,17 20,00 - Vi nấm Mg 17,33 19,12 19,33 - Ca - Mf - Chú thích: Sa: S aureus, Pa: P aegrunosa, Ec: E coli, Tm: T mentagrophytes, Tr: T rubrum, Mg: M gypseum, Ca: C albicans, NH: n – hexan, DCM: Dicloromethan, “ – “: không xác định được, EtOAc: Ethylacetat, Mf: Malassezia furfur Nhận xét: Kết bảng cho thấy, cao mentagrophytes, T rubrum, M gypseum, S aureus toàn phần cao phân đoạn DCM, EtOAc MRSA; khơng có tác động kháng E coli, P cho phổ kháng khuẩn kháng nấm tương tự aeruginosa, C albicans M furfur Cả loại cao cho tác động T Bảng 2: Kết MIC cao toàn phần cao phân đoạn vi sinh vật thử nghiệm (µg/ml) Cao TP DCM EtOAc Vi khuẩn S aureus MRSA 1223,25 1223,25 1196,55 1196,55 1410,45 1410,45 Vi nấm T rubrum 101,94 99,71 117,54 T mentagrophytes 101,94 99,71 117,54 Nhận xét: Từ giá trị MIC bảng cho thấy M gypseum 101,94 99,71 117,54 cộng (3000 µg/ml)(5) Kết tương cao DCM cao tồn phần có hoạt tính kháng đương vi sinh vật thử nghiệm tương đương Phongpaichit cộng sử dụng dịch chiết cao so với cao EtOAc Giá trị MIC cao thân rễ rễ Ngải bún với dung môi EtOH toàn phần S aureus thấp so với kết 96%, CHCl3 methanol chủng M nghiên cứu Ekkarin Pattaratanawadee gypseum có giá trị MIC từ 64 – 128 µg/ml(6) Chuyên Đề Dƣợc với nghiên cứu Souwalak 471 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Phân lập hoạt chất kháng vi sinh vật cao NB Xác định vết có hoạt tính kháng vi sinh vật kỹ thuật hình sinh học Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng cao NB cho 18 vết UV365, đó: Vết số với Rf = 0,58; cho phát quang màu vàng cam cho vòng ức chế M gypseum Vết với Rf = 0,52; phát quang màu cam cho vòng ức chế M gypseum S aureus Vết 10 với Rf = 0,48; phát quang (khơng xác định màu) cho vòng ức chế S aureus Từ kết tự sinh đồ (hình 1), chúng tơi chọn vết làm mục tiêu phân lập S aureus M gypseum Hình 1: Kết kỹ thuật hình sinh học phát vết có hoạt tính kháng vi sinh vật Phân lập hoạt chất kháng vi sinh vật phương pháp sắc ký cột cổ điển Cao NB sau triển khai qua cột thu 70 PĐ, gộp PĐ có chứa mục tiêu phân lập thành phân đoạn lớn: PĐ – A (42 – 49) PĐ – B (50 – 57) Phân đoạn B tinh khiết hơn, có vết Sau triển khai sắc ký cột cổ điển PĐ – B (Cột 2), thu 40 PĐ Từ kết SKLM, tiến hành gộp PĐ có chứa mục tiêu, để bay dung mơi tự nhiên, thu cắn màu trắng lẫn vàng: PĐ – B1 (13 -15) 20mg, PĐ – B2(16 -18) 5mg, PĐ – B3 (19 – 20) 19,1 mg, PĐ – B4 (21 – 25) 23,9 mg Tiến hành rửa phân đoạn B1 nhexan EtOAc để tách riêng phần bột màu trắng ngà, thu chất NB1 (3,6 mg) Kiểm tra độ tinh khiết chất NB1 UPLC Kết hình cho thấy sắc ký đồ chất NB1 cho đỉnh 27,324 phút, có độ tinh khiết lớn 95%, đủ điều kiện để tiến hành xác định cấu trúc phổ NMR Hình 2: Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết chất NB1 UPLC 472 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Xác định cấu trúc hợp chất NB1 NB1 tủa MeOH dạng bột vơ định hình, màu trắng ngà, dễ tan CHCl3, EtOAc, MeOH, tan n – hexan Trên silica gel 60 F254 cho vết tắt quang màu xanh nhạt UV254, màu hồng đậm với thuốc thử VS Đồng thời NB1 cho kết dương tính với phản ứng cyanidin Có thể sơ kết luận NB1 flavonoid Phổ 13C – NMR NB1 cho thấy diện 12 tín hiệu carbon, có tín hiệu cao bất thường 128,89 ppm 126,15 ppm Vậy, cấu trúc NB1 có đối xứng Thêm vào đó, đ{nh giá phổ DEPT cường độ tín hiệu carbon 128,89 ppm cao so với tín hiệu 126,15 ppm, vị trí 128,89 ppm tổ hợp tín hiệu carbon có độ dời hóa học Nghiên cứu Y học Từ lý luận trên, cấu trúc NB1 có 15 carbon, có: nhóm CH2 (δC 43,36 ppm) nhóm CH (δC 128,89; 126,15; 96,81; 95,53; 79,22 ppm) carbon bậc 4, đó: nhóm CIV sp3 (δC 164,93; 164,39; 163,17; 138,38; 103,16 ppm) nhóm >C=O (δC 195,71 ppm) Các liệu phổ NMR NB1 gần hoàn toàn phù hợp với pinocembrin điều khẳng định qua liệu phổ HSQC, HMBC, COSY(1,4) Dưới đ}y liệu phổ NMR NB1 so sánh với pinocembrin trình bày bảng Bảng 3: So sánh liệu phổ 13C – NMR (125 MHz) 1H – NMR (500 MHz) NB1 pinocembrin C DEPT CH δC 79,22 CH2 43,36 10 1’ 2’,6’ 3’, 4’,5’ >C=O =CH– =CH– =C< =CH– =C< =C< =C< =CH< =CH< 195,71 164,39 96,81 164,93 95,53 163,17 103,16 138,38 126,15 128,89 δH (J, Hz) 5,42dd (13,3) 3,08 dd (17,13) 2,82 dd (17,3) 6,01 d(2,0) 6,00 d(2,0) 7,42 m 7,42 m NB1 (CDCl3) HMBC (HCn) C – 2’, 6’ COSY H–3 C – 2, 1’, H– C– 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 C – 6, 10, C – 1’, 2’, 3’, 4’, 5’, 6’ C – 1’, 2’, 3’, 4’, 5’, 6’ - Dưới đ}y công thức khai triển pinocembrin (5,7 – dihydroxyflavanon) - Pinocembrin (DMSO – d6) (1) (4) δC δH (J, Hz) 78,4 5,58 dd (13,3) 3,23 dd (17,13) 42,2 2,72 dd (17,3) 195,8 163,6 96,1 5,93 d (2,0) 166,6 95,1 5,90 d (2,0) 162,7 101,9 138,0 126,5 7,41 – 7,55 m 128,5 - Bằng kỹ thuật tự sinh đồ, chất NB1 có hoạt tính kháng vi sinh vật thử nghiệm (hình 4) T mentagrophytes Hình 3: Công thức khai triển pinocembrin Chuyên Đề Dƣợc S.aureus Hình 4: Kết tự sinh đồ chất NB1 T mentagrophytes S aureus 473 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 KẾT LUẬN Các cao ethanol, cao phân đoạn n-hexan, dichloromethan ethylacetat chiết từ thân rễ rễ Ngải bún cho tác động kháng S aureus, MRSA với MIC khoảng 1100 – 1500 µg/ml; T mentagrophes, T rubrum M gypseum với MIC khoảng 90 – 120 µg/ml Hợp chất cho tác động kháng khuẩn kháng nấm da phân lập sắc ký cột cổ điển xác định cấu trúc hóa học phổ NMR pinocembrin KẾT QUẢ Các kết tiền đề cho nghiên cứu để ứng dụng thân rễ rễ Ngải bún nguồn nguyên liệu kháng vi sinh vật TÀI LIỆU THAM KHẢO 474 Agrawal P (2013) Carbon – 13 NMR of flavonoids pp 78 – 101, Elsevier, Amsterdam Chahyadi A, Rika H, and Komar RW (2014) Boesenbergia pandurata Roxb, an Indonesian medicinal plant: phytochemistry, biological activity, plant biotechnology Procedia Chemistry 13, pp.13-37 Choma I (2011) Bioautography detection in thin – layer chromatography Journal of Chromatography A 1218, pp.2684 – 2691 Liu Y (1992) Isolation of potential cancer chemopreventive agents from Eriodictyon californicum Journal of natural products 55, pp.357 – 363 Pattaratanawadee E (2006) Antimicrobial activity of spice extracts against pathogenic and spoilage microorganisms Kasetsart J Nat Sc 40, pp 159 – 165 Phongpaichit S (2005) Antifungal activities of extracts from Thai medicinal plants against opportunistic fungal pathogens associated with AIDS patients Mycoses 48, pp 333 – 338 Wayne P (2008) CLSI Document M38 – A2 Clinical and Laboratory Standards Institute Wuzy (2000) Flora of China pp 367 – 368 Ngày nhận báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2017 Ngày báo đăng: 15/03/2018 Chuyên Đề Dƣợc ... sóng 288,7 nm; thời gian chạy 55 phút Xác định cấu trúc hoạt chất kháng vi sinh vật cao NB phổ NMR Tác động kháng vi sinh vật cao NB cao phân đoạn Ngải bún xác định phương pháp khuếch tán qua đĩa... Trichophyton mentagrophytes, T 470 Phân lập hoạt chất kháng vi sinh vật có cao NB Kỹ thuật hình sinh học với kết hợp sắc ký lớp mỏng xác định tác động kháng vi sinh vật hợp chất phân tách bảng mỏng sắc... chứng minh hoạt tính kháng vi sinh vật thân rễ rễ Ngải bún VẬT LIỆU –PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Nguyên liệu Thân rễ rễ Ngải bún thu mua thị trấn Trà Cú, tỉnh Trà Vinh vào tháng 10/2016; định danh cách