Đề tài này được thực hiện với mục tiêu phân lập, xác định cấu trúc một số hợp chất tự nhiên từ lá thông đỏ lá dài và thiết lập chất chuẩn đối chiếu từ hợp chất taxoid phân lập được. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN TỪ LÁ THÔNG ĐỎ LÁ DÀI (TAXUS WALLICHIANA ZUCC.), THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU TAXUSPINE F ĐÃ PHÂN LẬP Hứa Hoàng Oanh*, Trần Ngọc Thùy Dương*, Bùi Thị Bích Trâm*, Hà Diệu Ly**,Bùi Thế Vinh***, Trần Cơng Luận***, Nguyễn Đức Tuấn* TĨM TẮT Mở đầu: Thơng đỏ dài (Taxus wallichiana Zucc.) dược liệu quý, trồng Lâm Đồng với triển vọng nguồn cung cấp nguyên liệu cho việc sản xuất thuốc trị ung thư Do đó, việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu đánh giá chất lượng taxoid chiết tách từ thông đỏ dài quan trọng cần thiết Chính vậy, đề tài thực với mục tiêu phân lập, xác định cấu trúc số hợp chất tự nhiên từ thông đỏ dài thiết lập chất chuẩn đối chiếu từ hợp chất taxoid phân lập Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: cao methanol 60% thông đỏ dài.Phương pháp nghiên cứu: Xử lý cao: loại tạp phân cực có cao methanol 60% ether dầu hỏa Phân lập xác định cấu trúc hợp chất tự nhiên: phân lập hợp chất tự nhiên từ cao sau loại tạp kỹ thuật sắc ký cột cổ điển, sắc ký lỏng hiệu cao điều chế phương pháp kết tinh dung môi, xác định cấu trúc chất phân lập phương pháp phổ nghiệm UV-Vis, IR, MS, NMR Sau cùng, độ tinh khiết chất phân lập xác định kỹ thuật HPLC pha đảo với đầu dò PDA Thiết lập chất chuẩn thiên nhiên theo hướng dẫn WHO, ASEAN ISO/IEC 15328: đánh giá chất chuẩn định tính dựa giá trị: phổ UV-Vis, IR, MS, NMR, định lượng HPLC; đóng gói, đánh giá đồng nhất, đánh giá liên phòng thí nghiệm (ba phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP) Kết quả: Từ 75 g cao methanol 60% phân lập 425 mg hợp chất taxinine B (độ tinh khiết > 98%), 732 mg hợp chất taxuspine F (độ tinh khiết > 97%) 310 mg hợp chất bis-(2-ethylhexyl)-phtalate Theo hướng dẫn WHO, ASEAN ISO/IEC 15328, 300 mg chất chuẩn taxuspine F thiết lập đạt độ đồng đóng gói độ tinh khiết 97,46% Kết luận: Đề tài phân lập hai taxoid taxinine B taxuspine F, hợp chất bis-(2-ethylhexyl)phtalate từ thông đỏ dài (Taxus wallichiana Zucc.) trồng Lâm Đồng Trong đó, bis-(2-ethylhexyl)-phtalate phân lập lần từ Taxus wallichiana Thiết lập chất chuẩn đối chiếu taxuspine F đạt độ tinh khiết 97,46% Từ khóa: Taxus wallichiana, taxinine B, taxuspine F, bis-(2-ethylhexyl)-phtalate, reference standard ABSTRACT ISOLATION AND STRUCTURAL IDENTIFICATION OF CHEMICAL CONSTITUENTS FROM THE NEEDLES OF TAXUS WALLICHIANA ZUCC., AND ESTABLISHMENT OF REFERENCE STANDARD TAXUSPINE F Hua Hoang Oanh, Tran Ngoc Thuy Duong, Bui Thi Bich Tram, Ha Dieu Ly, Bui The Vinh, Tran Cong Luan, Nguyen Duc Tuan * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No – 2014: 235 - 242 * Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh *** Trung tâm Sâm Dược liệu TP HCM Tác giả liên lạc: ThS Hứa Hoàng Oanh Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền ** Viện Kiểm nghiệm thuốc TP HCM ĐT: 0909 62 32 35 Email: oanhhuahoang@yahoo.com 235 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Background – Objectives: Taxus wallichiana Zucc is a precious medicinal herb with prospect of becoming the source for supplying raw material to produce anti-cancer drugs Therefore, standardization of this herb as well as evaluation of quality of the taxoids extracted from Taxus wallichiana Zucc are very important and necessary Thus, the aim of this study was to isolate, identify chemical structure of chemical constituents from the needles of Taxus wallichiana Zucc and establish reference standard from one of isolated taxoids Materials and Methods: Materials: 60% methanol extract from the needles of Taxus wallichiana Zucc cultivated in Lam Dong province Methods: Isolated and identification of chemical constituents: Low polar residues from 60% methanol extract were removed by petroleum ether, the constituents were isolated and purified from the resultant methanol extract by column chromatography, preparative HPLC, and crystallization in solvent Then, the purified compounds was elucidated chemical structure by means of UV-Vis, IR, MS, NMR spectroscopy Finally, the purity of two taxoids was determined by reversed phase HPLC with PDA detector Establishment of reference standard taxuspine F according to the guidelines of WHO, Asean and ISO/IEC 15328: Basing on the data of infrared spectrometry, ultraviolet spectrometry, mass spectrometry, nuclear magnetic resonance spectrometry and high performance liquid chromatography, the quality and quantity of taxuspine F were evaluated In addition, the validation of method and the assessment of inter-laboratories were conducted to set up the assigned values of the established reference standard Results: From 75 g of 60% methanol extract, the isolated taxoids were identified as taxinine B (425 mg) with over 98% purity and taxuspine F (732 mg) with over 97% purity; furthermore, bis-(2-ethylhexyl)-phtalate was separated about 310 mg 300 mg of taxuspine F (97,46% purity), which was isolated in this study, was established as reference standard according to the guidelines of WHO, Asean and ISO/IEC 15328 Conclusion: Two taxanes, taxinine B and taxuspine F were successfully isolated from the needles of Taxus wallichiana Zucc cultivated in Lam Dong province Bis-(2-ethylhexyl)-phtalate is isolated from Taxus wallichiana for the first time Taxuspine F was established as the reference standard and the assigned value reached 97,46% purity Key words: Taxus wallichiana, taxinine B, taxuspine F, bis-(2-ethylhexyl)-phtalate, reference standard MỞ ĐẦU Paclitaxel (Taxol®) dùng điều trị nhiều loại ung thư: ung thư vú, ung thư phổi, điều trị ung thư Kaposi sarcoma có liên quan đến AIDS(3,4,12) Để điều trị cho bệnh nhân cần trung bình khoảng 2g paclitaxel chiết từ 3-10 thông đỏ (Taxus baccata) Việc chiết xuất paclitaxel chủ yếu từ vỏ đưa vào khai thác để cung cấp nguồn nguyên liệu làm thuốc cần phải tiến hành tiêu chuẩn hóa dược liệu Mục tiêu nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc số hợp chất tự nhiên từ thông đỏ dài (Taxus wallichiana Zucc.); bước đầu thiết lập chất chuẩn từ taxoid phân lập được, dùng kiểm tra chất lượng dược liệu chế phẩm liên quan hoạt chất tập trung nhiều, đó, làm ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU cạn kiệt nguồn dược liệu(8) Vì vậy, Việt Nam Đối tượng tiến hành trồng thông đỏ dài (Taxus Cao chiết methanol phân đoạn 60% (gọi tắt wallichiana Zucc.) nghiên cứu chiết xuất cao methanol 60%) từ thông đỏ dài paclitaxel, 10-DAB từ nhằm thay nguồn trồng Lâm Đồng, nguồn dược liệu nguyên liệu vỏ Tuy nhiên, để thơng đỏ tiêu chuẩn hóa Qui trình chiết xuất trình dài (Taxus wallichiana Zucc.) trồng Lâm Đồng bày sơ đồ 236 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Dược liệu (25 kg) Chiết ngấm kiệt với MeOH, tỷ lệ 1:6 Dịch chiết MeOH (150 lít) Cơ quay áp suất giảm, thu hồi MeOH Cao khô MeOH (8 kg) Hòa cao khơ với lít nước Lắc với CH2Cl2(96 lít) Cao CH2Cl2 (1600 g) Sắc ký cột Diaion HP20 Phân đoạn cao MeOH 60% (1600 g) Sơ đồ 1: Quy trình chiết xuất phân đoạn cao methanol 60% Phương pháp nghiên cứu Phân lập hợp chất Cao methanol 60% lắc phân bố với ether dầu hỏa (PE) để loại tạp phân cực, sau đó, tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CHCl3-MeOH (9:1) thu kết tinh KT1 (phân đoạn I) phân đoạn II - IX Phân đoạn II tiếp tục tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi PE-aceton (7:3) thu kết tinh KT2 (phân đoạn IIA) phân đoạn IIB đến IIF Kết tinh KT1 KT2 tinh chế kiểm tra lại sắc ký lớp mỏng, gộp lại thành kết tinh TW1; sau đó, kiểm tra độ tinh khiết HPLC pha đảo với đầu dò PDA Kết tinh TW1 tiến hành HPLC điều chế thu hợp chất T1 có độ tinh khiết 98% hợp chất 100 mg hợp chất T3 Từ phân đoạn IIB đến IIF thu kết tinh TW2, hợp chất tinh chế kiểm tra độ tinh khiết HPLC pha đảo với đầu dò PDA Tiếp theo thực HPLC điều chế kết tinh TW2 thu hợp chất T2 có độ tinh khiết 97% hợp chất 210 mg hợp chất T3 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Nghiên cứu Y học Xác định cấu trúc Dựa vào kết phân tích phổ UV-Vis, IR, MS, NMR xác định hợp chất T1 taxinine B, hợp chất T2 taxuspine F hợp chất T3 bis-(2-ethylhexyl)-phtalate Điều kiện sắc ký lỏng hiệu cao Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phân tích Water Alliance 2695 – đầu dò dãy diod quang (PDA), cột Xterra C18 (250 x 4,6 mm; µm) HPLC phân tích sử dụng để đánh giá độ tinh khiết hợp chất phân lập Hệ thống HPLC điều chế Merck-Knauer, đầu dò UV K-2600, cột Phenomenex Gemini RP C18 (250 x 21,20 mm; µm) Phương pháp HPLC điều chế áp dụng để tinh chế hợp chất phân lập Các điều kiện tiến hành HPLC phân tích HPLC điều chế trình bày bảng Bảng 1: Điều kiện sắc ký đánh giá độ tinh khiết tinh chế hợp chất phân lập Điều kiện sắc ký Pha động Nhiệt độ cột Bước sóng phát Tốc độ dòng Thể tích tiêm mẫu HPLC HPLC điều chế ACN-nước (95:5) ACN-nước (95:5) 25ºC 25ºC 210 nm 210 nm ml/phút ml/phút 10 µl 10 ml Thiết lập chất chuẩn Hợp chất taxuspine F sau phân lập xác định cấu trúc kết phân tích phổ nghiệm UV-Vis, IR, MS, NMR Hợp chất có độ tinh khiết cao 97% đánh giá phương pháp HPLC, dùng làm nguyên liệu để thiết lập chất chuẩn điều chế qua bước sau đây: Định lượng thẩm định qui trình định lượng HPLC Vì khơng có chất chuẩn đối chiếu taxuspine F, kết định lượng taxuspine F điều chế tính theo phương pháp HPLC qui 100% diện tích pic sắc ký đồ Qui trình định lượng thẩm định bao gồm khảo sát tính phù hợp hệ thống, tính chọn lọc, khoảng tuyến tính độ lặp lại 237 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Thiết lập chất chuẩn taxuspine F Qui trình thiết lập chất chuẩn taxuspine F gồm bước: đóng gói, đánh giá độ đồng lọ, đánh giá kết định lượng liên phòng thí nghiệm ba phòng thí nghiệm đạt GLP, xác định giá trị ấn định phiếu kiểm nghiệm(6,7,11) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Phân lập hợp chất Từ 75 g cao methanol 60% phân lập 720 mg phân đoạn giàu hợp chất T1 935 mg phân đoạn giàu hợp chất T2 phương pháp sắc ký cột cổ điển Sau tinh khiết hóa kỹ thuật HPLC điều chế thu 425 mg hợp chất T1 (độ tinh khiết > 98%), 732 mg hợp chất T2 (độ tinh khiết > 97%) 310 mg hợp chất T3 Xác định cấu trúc Hợp chất T1 Hợp chất T1 kết tinh dạng tinh thể nhỏ, mịn, khơng màu, có ánh lấp lánh, dễ tan cloroform, acetonitril, ethyl acetate, tan methanol Phổ UV T1 MeOH cho đỉnh hấp thu cực đại bước sóng 217 279,4 nm Điều phù hợp với taxoid taxoid có đỉnh hấp thu cực đại khoảng 190 – 300 nm(5) Các băng hấp thụ đáng ý phổ IR T1: 1684 cm-1 (C=O), 1634 cm-1 (C=C), 1132 cm-1 1070 cm-1 (C-O-C) Điều phù hợp với taxoid cấu trúc taxoid có diện nhóm carbonyl ester vị trí C5, nhóm ceton (C=O) vị trí C13(5) Phổ MS – ES+ MeOH cho thấy ion có m/z = 687,28 với cường độ cao nhất, mảnh [M+Na]+, T1 có khối lượng phân tử 664 Dalton, có khả tương ứng với công thức phân tử hợp chất taxoid taxinine B (C37H44O11) (2) So sánh dữ liệu phổ 1H NMR 13C NMR T1 với chất được cơng bố dữ liệu phổ T1 hoàn toàn trùng khớp với liệu phổ taxinine B(2) 238 Bảng 2: So sánh phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) T1 taxinine B(2) C 6a 6b 10 11 12 13 14a 14b 15 16 17 18 19 20a 20b 21 22 23 2-OAc Me 7-OAc Me 9-OAc Me 10-OAc Me 1’ 2’, 6’ 3’, 5’ 4’ Hợp chất T1 (trong Taxinine B (trong CDCl3) CDCl3) δC δC δH (J, Hz) δH (J, Hz) 2,25; d (7) 48,7 2,24; d (1,5; 7) 48,7 5,62; dd (1,5; 5,63; dd (1,5; 6,5) 68,6 68,6 6,5) 3,33; d (6) 42,0 3,32; d (6,5) 42,0 139,8 139,8 5,39; s 76,2 5,38; t (3) 76,2 1,77; s 1,75; m 35,1 35,1 2,08; m 2,11; m 5,45; m 69,6 5,44; dd (6; 11) 69,6 47,6 47,6 5,94; d (11) 75,0 5,94; d (10,5) 75,0 6,25; d (10,5) 72,8 6,24; d (10,5) 72,8 150,5 150,5 138,6 138,6 199,3 199,3 2,39; d (21) 2,34; d (20) 36,2 36,2 2,85; dd (7; 20) 2,84; dd (7; 20) 37,7 37,4 1,15; s 37,3 1,15; s 37,8 1,77; s 25,3 1,76; s 25,3 2,39; s 14,3 2,38; s 14,3 1,03; s 13,2 1,02; s 13,2 4,92; s 4,92; s 118,8 118,8 5,45; s 5,43; s 166,2 166,2 6,45; d (16) 117,4 6,44; d (16) 117,4 7,69; d (16) 146,4 7,68; d (16) 146,4 169,3 169,3 2,08; m 20,8 2,06; s 20,8 169,7 169,7 2,08; m 21,3 2,06; s 21,3 169,7 169,7 2,08; m 21,4 2,06; s 21,4 169,2 169,2 2,08; m 20,7 2,02; s 20,7 134,5 134,5 7,78; d (7) 129,0 7,77; d (7) 129,0 7,47; m 128,6 7,42; m 128,6 7,44; m 130,5 7,42; m 130,5 Hình 1: Cấu trúc hóa học taxinine B Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Từ kết phổ nghiệm UV-Vis, IR, MS, NMR, hợp chất T1 xác định taxinine B Taxinine B có tên gọi khác 7β-acetate-Otaxinine A Woods M.C cộng phân lập lần vào năm 1968 từ Taxus cuspidata Sieb et Zucc.(3) Sau đó, vào năm 1988, Yeh M.K cộng phân lập hợp chất từ gỗ Taxus mairei(3) Hợp chất T2 Hợp chất T2 có dạng rắn vơ định hình, màu trắng, tan methanol, acetonitril, cloroform T2 có cực đại hấp thu bước sóng 266,7 nm; phù hợp với phổ UV taxuspine F công bố(9,10) Phổ hồng ngoại T2 tương tự Nghiên cứu Y học taxuspine F(9,10), có đỉnh hấp thu tương ứng với nhóm chức: 3450 cm-1 (nhóm -OH), 1747 cm-1 1679 cm-1 (C=O), 1199 cm-1 (C-O-C) Trên phổ MS, T2 cho mũi cao tương ứng với m/z = 557,22 phù hợp với mảnh [M+Na]+ Do vậy, T2 có khối lượng phân tử 534,2 Dalton, tương ứng với cơng thức phân tử C28H38O10, công thức phân tử với taxuspine F (9,10) So sánh liệu phổ 1H NMR 13C NMR T2 với chất công bố cho thấy cấu trúc T2 hoàn toàn trùng khớp với cấu trúc taxuspine F(9,10) Bảng 3: So sánh phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) T2 taxuspine F (9,10) C 2-OAc Me 7-OAc Me 9-OAc Me 10 10-OAc Me 11 12 13 DEPT CH CH C CH3 CH C CH CH2 CH C CH3 C CH C CH3 CH C CH3 C C C 14 CH2 15 16 17 18 19 20 C CH3 CH3 CH3 CH3 CH2 Hợp chất T2 (trong CDCl3) δC δH (J, Hz) 48,8 2,20 d (6,0) 68,9 5,6 (dd; 1,5: 6,0) 169,7 21,3 2,05 (s) 39,7 3,53 (d; 6,0) 139,2 74,5 4,22 (d; 2,5) 37,5 1,61(m) 1,94 (m) 69,5 5,50 (dd; 5,5; 11,5) 169,2 21,3 2,08 (s) 47,8 75,1 5,90 (d; 11,0) 169,3 20,9 2,05 72,8 6,26 (d; 11,0) 169,8 20,7 2,02 149,8 144,7 199,4 2,33 (dd; 19,5) 36,1 2,77 (dd; 7,0; 20,0) 37,8 25,4 1,74 (s) 37,4 1,11 (s) 14,5 2,33 (s) 12,9 0,98 (s) 115,5 4,81 (s); 5,23 (s) Dựa vào kết phổ: UV-Vis, IR, MS, NMR, hợp chất T2 xác định taxuspine F Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Taxuspine F (trong CDCl3) δH (J, Hz) 2,20 (dd; 2,0; 6,5) 5,6 (dd; 2,0; 6,0) 2,05 (s) 3,55 (d; 6,0) 4,22 (d; 2,0) 1,61 (m) 1,94 (ddd; 3,0; 5,5; 13,5) 5,52 (dd; 5,5;11) 2,08(s) 5,90 (d; 10,5) 2,05 6,25 (d; 10,5) 2,02 2,33 (d; 19,5) 36,1 2,76 (dd; 6,5; 19,5) 37,8 25,4 1,74 (s) 37,4 1,12 (s) 14,5 2,31 (s) 12,9 0,98 (s) 115,5 4,82 (s); 5,23 (s) δC 48,8 69,0 169,4 21,3 39,7 139,2 74,5 37,6 69,6 169,2 21,4 47,9 75,2 169,4 20,9 72,8 169,8 20,7 149,9 144,8 199,6 Taxuspine F phân lập từ Taxus cupidata Sieb.et Zucc năm 1995 từ Taxus 239 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 wallichiana Zucc Nguyễn Thị Thanh Tâm năm 2007(10) Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) T3 có mũi vị trí δ 68,17 (t, C-1); 38,75 (d, C-2); 30,38 (t, C-3); 22,98 (t, C-4); 28,93 (t, C-5); 14,04 (q, C-6); 23,77 (t, C-7); 10,96 (q, C-8); 167,76 (s, C=O); 132,47 (s, C-1’); 128,81 (d, C-2’); 130,87 (d, C-3’) Hình 2: Cấu trúc hóa học taxuspine F Hợp chất T3 Hợp chất T3 có dạng dầu, suốt, không màu, không mùi Phổ UV T3 có cực đại hấp thu bước sóng 274,4-276,8 nm Phổ MS – ES+ MeOH T3 có m/z = 413,17 mảnh [M+Na]+, khối lượng phân tử T3 390,27 Dalton, có khả tương ứng với công thức phân tử hợp chất bis(2-ethylhexyl)-phtalate (C24H38O4) (1) So sánh liệu phổ NMR chiều hai chiều T3 với chất cơng bố hồn tồn trùng khớp với cấu trúc hợp chất bis(2-ethylhexyl)-phtalate (1) Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) T3 có mũi vị trí δ 4,25 (2H, m); 1,70 (1H, m); 1,25~1,46 (8H, m); 0,88 (3H, t, J=4,5 Hz); 0,93 (3H, t); 7,71 (1H, m); 7,53 (1H, m) (a) Hình 3: Cấu trúc hóa học bis-(2-ethylhexyl)phtalate Bis-(2-ethylhexyl)-phtalate hợp chất phân lập lần từ Taxus wallichiana Zucc Hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn Gram âm Gram dương (1) Đánh giá độ tinh khiết taxinine B taxuspine F Độ tinh khiết hợp chất taxoid phân lập đánh giá phương pháp HPLC phân tích Độ tinh khiết taxinine B 98% taxuspine F tinh khiết 97% (b) Hình 4: Độ tinh khiết sắc ký (a): taxinine B, (b): taxuspine F Điều kiện tiến hành sắc ký trình bày bảng 240 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Thiết lập chất chuẩn Định lượng thẩm định qui trình định lượng HPLC Bảng 4: Kết thẩm định qui trình định lượng taxuspine F điều chế HPLC Tính tương thích hệ thống Tính chọn lọc Độ lặp lại (n=6) Tính tuyến tính Độ (n=6) RSD (tR) = 0,09% < 1% RSD (Spic) = 0,51% < 2% Đạt RSD = 0,13% < 2% R = 0,9992 > 0,995 97,77% Nhận xét: qui trình định lượng HPLC đạt yêu cầu tính phù hợp hệ thống, tính chọn lọc, khoảng tuyến tính độ lặp lại Hàm lượng taxuspine F điều chế tính theo phương pháp HPLC qui 100% diện tích pic sắc ký đồ Kết quả: hàm lượng taxuspine F 97,77% tính chế phẩm nguyên trạng Thiết lập chất chuẩn taxuspine F Đóng gói đánh giá độ đồng lọ 300 mg taxuspine F điều chế đóng gói vào 30 lọ, khối lượng đóng gói: 10 mg/ lọ Điều kiện đóng gói: buồng Glove-box chứa 99,99% khí nitơ nhiệt độ phòng (25ºC) độ ẩm 30 – 40% Đánh giá độ đồng lọ sau đóng gói: số lọ đánh giá (g) chọn ngẫu nhiên, số lượng lọ tính cơng thức = (N: tổng số lọ) Mỗi lọ định lượng lần để tránh sai số dùng phép kiểm Dixon để loại giá trị bất thường kết định lượng Bảng 5: Kết phân tích phương sai ANOVA yếu tố Tổng bình Bậc tự Bình F Ftc phương phương tn Giữa nhóm 0,002 0,002 0,127 4,964 Trong nhóm 0,169 10 0,016 Tổng cộng 0,171 11 Nhận xét: Ftn = 0,127 < Ftc = 4,964 nên lọ chất chuẩn đạt yêu cầu độ đồng lọ Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Nghiên cứu Y học Đánh giá kết định lượng liên phòng thí nghiệm Bảng 6: Kiểm tra tính phù hợp hệ thống kết định lượng taxuspine F điều chế phòng thí nghiệm (n=6) PTN 1* 97,72% Hàm lượng trung bình Số đĩa lý thuyết (phải lớn 35,679 30,000) RSD thời gian lưu (phải 0,11% nhỏ 2%) RSD hàm lượng (phải nhỏ 0,12% 2%) PTN 2* 97,00% PTN 3* 97,61% 36,559 36,659 0,13% 0,22% 0,36% 0,34% * PTN 1: Khoa Thiết lập chất chuẩn – chất đối chiếu, Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh PTN 2: Khoa Vật lý đo lường, Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh PTN 3: Phòng Đảm bảo chất lượng, Cơng ty cổ phần Dược phẩm Cửu Long Xác định giá trị ấn định Bảng 7: Kết tính giá trị ấn định hàm lượng taxuspine F điều chế (n = 18) * δ = 1,5 x s * x -δ * x +δ Trung bình Độ lệch s * x * s x0 - * x1 0,613 97,024 98,250 * x2 0,611 96,881 98,103 * 97,462 0,405 97,637 0,409 97,492 0,359 97,492 0,407 97,492 0,359 97,492 0,407 Từ kết trên, tính z-score Tất 18 giá trị định lượng có < Như vậy, độ tinh khiết taxuspine F điều chế tính chế phẩm nguyên trạng 97,46% với độ không đảm bảo đo 0,12 độ lệch 0,409 KẾT LUẬN Nghiên cứu áp dụng phương pháp sắc ký cột cổ điển đơn giản dung môi thông dụng để phân lập hợp chất taxoid cao methanol 60% chiết từ thơng đỏ dài (Taxus wallichiana Zucc.) Ngồi ra, phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao điều chế ứng dụng để tinh khiết hợp chất phân lập Cấu trúc hợp chất xác định dựa vào kết phân tích phổ UV-Vis, IR, MS, NMR Hai hợp chất taxoid phân lập taxinine B taxupine F có độ tinh khiết cao 97%, đủ điều 241 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 kiện để thiết lập chất chuẩn đối chiếu hợp chất phân lập lần từ Taxus wallichiana bis-(2-ethylhexyl)-phtalate Hợp chất taxuspine F phân lập sử dụng làm nguyên liệu để thiết lập chất chuẩn đối chiếu theo hướng dẫn WHO ASEAN Lô chất chuẩn đóng gói đánh giá độ đồng thẩm định ba phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP Chất chuẩn taxuspine F điều chế có độ tinh khiết cao 97,46% (tính chế phẩm nguyên trạng), sử dụng kiểm nghiệm dược liệu thông đỏ dài Việt Nam (Taxus wallichiana Zucc.) chế phẩm liên quan TÀI LIỆU THAM KHẢO Al-Bari MAA, Sayeed MA, Rahman MS and Mossadik MA (2006) Characterization and Antimicrobial Activities of a Phthalic Acid Derivative Produced by Streptomyces bangladeshiensis A Novel Species Collected in Bangladesh Research Journal of Medicine and Medical Sciences, 1(2): 77-81 Baloglu E, Kingston DGI (1999) The Taxane Diterpenoids J Nat Prod.; 62: 1448-1472 Brambilla L, Romanelli A, Bellinvia M, Ferrucci S, Vinci M, Boneschi V, Miedico A, Tedeschi L (2008) Weekly paclitaxel for advanced aggressive classic Kaposi sarcoma: experience in 17 cases Br J Dermatol; 158: 1339-1344 242 Dhillon T, Stebbing J, Bower M (2005) Paclitaxel for AIDSassociated Kaposi’s sarcoma Expert Rev Anticancer Ther; 5: 215219.3 Itokawa H, Lee KH (2003) Taxus The genus Taxus, Taylor and Francis Group, London, 180-205 ISO Guide 13528: 2005, Statistical methods for use in proficiency testing by inter-laboratory comparisons ISO Guide 35: 2006, Reference materials – General and statistical principles for certification Kikuchi Y, Yatagai M (2003) The commercial cultivation of Taxus species and production of taxoids In: Itokawa H, Lee KH (eds.) Taxus: The Genus Taxus CRC Press; 151-178 Kobayashi J, Inubushi A, Hosoyama H, Yoshida N, Sasaki T, Shigemori H (1995) Taxuspines E-H and J, New Taxoids from the Japanese Yew Taxus cuspidata Tetrahedron; 51: 5971-5978 10 Nguyen Thi Thanh Tam, Nguyen Trung Nhan (2009) The study on chemical constituents from the needles of Taxus wallichiana Zucc (Taxaceae) Journal Science and Technology Development; 12 (10): 53-57 11 WHO Expert Committee on Specific cations for Pharmaceutical Preparations: forty-first report (WHO technical report series; no 943) 12 Zhou J, Giannakakou P (2005) Targeting microtubules for cancer chemotherapy Curr Med Chem Anticancer Agents; 5: 65-71 Ngày nhận báo : 15/10/2013 Ngày phản biện nhận xét báo : 19/10/2013 Ngày báo đăng : 02/01/2014 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền ... tiêu nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc số hợp chất tự nhiên từ thông đỏ dài (Taxus wallichiana Zucc.); bước đầu thiết lập chất chuẩn từ taxoid phân lập được, dùng kiểm tra chất lượng dược... Phụ Số * 2013 kiện để thiết lập chất chuẩn đối chiếu hợp chất phân lập lần từ Taxus wallichiana bis-(2-ethylhexyl)-phtalate Hợp chất taxuspine F phân lập sử dụng làm nguyên liệu để thiết lập chất. .. 210 nm ml/phút ml/phút 10 µl 10 ml Thiết lập chất chuẩn Hợp chất taxuspine F sau phân lập xác định cấu trúc kết phân tích phổ nghiệm UV-Vis, IR, MS, NMR Hợp chất có độ tinh khiết cao 97% đánh