Tách chiết, xác định cấu trúc hóa học của hợp chất chính trong Viễn Chí (Polygala tenuifolia), góp phần xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu này trên thị trường

TÓM TẮT Đề tài: “Tách chiết, xác định cấu trúc hóa học của hợp chất chính trong Viễn Chí Polygala tenuifolia, góp phần xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu này trên thị trường”.. H

Ngành học inh viên th Niên khóa

BỘ GIÁO D

ỌC NÔNG HOA CÔN

: CÔNG N : NGUYỄ : 2009 - 20

háng 6/201

ĐÀO TẠO HÀNH PHỐ SINH HỌC

NH HỌC HẢO LINH

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn

Ban giám hiệu trường đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho

em sinh hoạt và học tập trong suốt 4 năm qua

Thầy Lê Đình Đôn, cô Tô Thị Nhã Trầm, các thầy cô trong Bộ Môn Công Nghệ

Sinh Học cùng các thầy cô trực tiếp giảng dạy em trong suốt quá trình học tập

PGS.TS Trần Công Luận, Giám đốc trung tâm Sâm và Dược liệu Tp Hồ Chí

Minh cùng các thầy cô trong trung tâm đã tạo điều kiện cho em được thực hành và

nghiên cứu để hoàn thành đề tài

Ths Bùi Thế Vinh, người thầy, người anh luôn tận tình hướng dẫn em từ lúc bắt

đầu thực hiện đến khi hoàn thành đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Hoa, chị Nguyễn Thi Ngọc Đan, anh

Lê Văn Huấn và các anh chị trong Trung tâm Sâm và Dược Liệu Tp HCM đã tận tình

chỉ bảo, truyền đạt kinh nghiệm cho em

Cảm ơn tất cả các bạn sinh viên cùng thực hiện đề tài tại Trung tâm Sâm và Dược

liệu Tp HCM đã giúp đỡ, khuyến khích, động viên, cùng tôi vượt qua những lúc khó

khăn trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp; các bạn sinh viên của lớp

DH09SH trường Đại học Nông Lâm Tp HCM đã giúp đỡ, an ủi, động viên tôi trong

quá trình học tập

Lời cảm ơn cuối cùng con xin chân thành gửi đến gia đình mình đã luôn tạo điều

kiện tốt nhất về tinh thần và vật chất cho con, luôn là chỗ dựa vững chắc cho con có

thể yên tâm học tập và hoàn thành tốt luận văn của mình

NGUYỄN THỊ THẢO LINH

TÓM TẮT

Đề tài: “Tách chiết, xác định cấu trúc hóa học của hợp chất chính trong Viễn Chí

(Polygala tenuifolia), góp phần xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu này trên

thị trường”

Viễn Chí (Polygala tenuifolia Willd) là một loại thảo dược quý, có nhiều hoạt

tính sinh học, từ lâu đã được con người khai thác để chữa bệnh Hợp chất Saponin trong Viễn Chí có nhiều hoạt tính quan trọng như: kháng khuẩn và kháng nấm, chống ung thư, tác dụng hướng sinh dục, tác dụng lên hệ thần kinh…Ở Việt Nam, các nghiên cứu trên loài cây này còn rất ít, nghiên cứu này được tiến hành nhằm làm tiền đề, định hướng cho các nghiên cứu trên đối tượng này

Mục đích của nghiên cứu này nhằm tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc hợp chất Saponin trong dược liệu Viễn Chí, bước đầu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu này trên thị trường

Nội dung chính của nghiên cứu: Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu Viễn Chí thu mua tại Chợ Hãi Thượng Lãn Ông, Việt Nam Áp dụng các phương pháp hóa học, kỹ thuật sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, kỹ thuật chiết tách lỏng - lỏng và lỏng – rắn…để phân lập các hợp chất chủ yếu trong dược liệu Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng kỹ thuật phổ NMR và MS Định lượng hợp chất phân lập được bằng phương pháp đo quang

Kết quả nghiên cứu khẳng định được sự hiện diện của hợp chất Saponin, đồng thời phân lập được được 1 hợp chất sapogenin là senegenin Hàm lượng senegenin trung bình có trong mẫu dược liệu là 4,73%

Từ khóa: Polygala tenuifolia Willd, Senegenin

SUMMARY

The thesis: “Separation, determination the chemical structure of the major

compounds in the roofs of Polygala tenuifolia Willd, contributing to develop the

standardization of this plant.”

Polygala tenuifolia Willd is a medicinal herb had been used widely in traditional

medicine Saponin is a principal component of Polygala tenuifolia Willd having

significant activities as: antibacterial and antifungal, anti-inflammatory, anticancer, effect of sexual orientation, acting on the nervous system…In VietNam, this plant mainly origined from China, and the quality control of this plant has not been carefully studied Thus, this thesis was conducted, which as a premise for the further studies and tended to closely standardise on this plant

Objective: extracting Saponin from Polygala tenuifolia Willd, purify the

Saponin compound, determining structure of the Saponn; develope the basic standardization of this plant

The main contents of my research was: to build a basic standardization of

Polygala tenuifolia Willd, which bought from “Hai Thuong Lan Ong” market,

VietNam Apply mechanisms such as Thin layer chromatographic techniques, Adsorption chromatography, liquid-liquid and liquid-solid extraction techniques…to separate the major Saponin compounds in this plant The chemical structure of the Saponin was determined by basing on NMR and MS spectral techniques Quantitative analysis of the content of Saponin compound by using spectrophotometry method

This research has confirmed the presence of Saponin compounds, and separated

a sapogenin compound in the roofs of Polygala tenuifolia Willd.The sapogenin isolated was determined as Senegenin, a triterpene compound normally exists in Polygala

tenuifolia Willd The content of senegenin compound from material are about 4,73 %

Key words: Polygala tenuifolia Willd, Senegenin

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Danh sách các chữ viết tắt vii

Danh sach các bảng viii

Danh sách các hình ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan dược liệu Viễn Chí 3

2.1.1 Vị trí phân loại 3

2.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố 4

2.1.3 Đặc điểm dược liệu Viễn chí 4

2.1.3.1 Mô tả thực vật rễ Viễn Chí 4

2.1.3.2 Vi phẫu rễ Viễn Chí 4

2.1.3.3 Bột dược liệu rễ Viễn Chí 4

2.1.4 Thành phần hóa học của rễ Viễn Chí 5

2.1.5 Tính dược lý của Viễn Chí 6

2.1.6 Tính vị, công năng của Viễn Chí 7

2.1.7 Công dụng của Viễn Chí 7

2.2 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước của Polygala tenuifolia Willd 7

2.2.1 Trên thế giới 7

2.2.2 Việt Nam 8

2.3 Tổng quan về hợp chất Saponin 8

2.3.1 Định nghĩa và phân loại 8

2.3.2 Tính chất của Saponin 8

2.3.3 Hoạt tính của Saponin 9

2.3.4 Sự phân bố trong thực vật 9

2.4 Phương pháp phân lập các hợp chất hữu cơ 10

2.4.1 Các kỹ thuật chiết tách các hợp chất ra khỏi cây 10

2.4.1.1 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt 10

2.4.1.2 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng 10

2.4.2 Sắc ký 11

2.4.2.1 Sắc ký lớp mỏng 11

2.4.2.2 Sắc ký cột cổ điển 12

2.5 Phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc của hợp chất hữu cơ 12

2.6 Phương pháp quang phổ hấp thu tử ngoại và khả kiến (UV-Vis) 13

2.6.1 Khái niệm 13

2.6.2 Đặc điểm 13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15

3.2 Vật liệu 15

3.2.1 Nguyên liệu 15

3.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 15

3.3 Phương pháp nghiên cứu 16

3.3.1 Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu 16

3.3.1.1 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của cao chiết Viễn Chí 16

3.3.1.2 Khảo sát độ tinh khiết của nguyên liệu 18

3.3.1.3 Định tính hợp chất chính trong rễ Viễn Chí bằng phản ứng hóa học 20

3.3.2 Phương pháp chiết xuất dược liệu và thu cao phân đoạn 20

3.3.2.1 Chiết xuất cao toàn phần 20

3.3.2.2 Chiết cao phân đoạn từ cao toàn phần 21

3.3.3 Khảo sát các cao phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng 21

3.3.4 Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột cổ điển 21

3.3.5 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được 23

3.3.6 Định lượng hợp chất trong Viễn Chí bằng UV-Vis dựa trên chất chuẩn 24

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu 26

4.1.1 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của cao chiết Viễn Chí 26

4.1.2 Khảo sát độ tinh khiết của nguyên liệu 27

4.1.2.1 Độ ẩm của rễ Viễn Chí 27

4.1.2.2 Độ tro toàn phần của rễ Viễn Chí 28

4.1.2.3 Độ tro không tan trong acid của rễ Viễn Chí 29

4.1.3 Định tính các hợp chất trong rễ Viễn Chí bằng phản ứng hóa học 29

4.2 Phương pháp chiết xuất dược liệu và thu cao phân đoạn 30

4.2.1 Kết quả chiết xuất cao toàn phần 30

4.2.2 Kết quả chiết cao phân đoạn 30

4.3 Kết quả khảo sát các cao phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng 31

4.4 Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất Saponin 32

4.4.1 Phân lập 32

4.4.2 Hợp chất SP 34

4.4.3 Định lượng hợp chất trong Viễn Chí bằng UV-Vis dựa trên chất chuẩn 38

4.4.3.1 Xây dựng quy trình định lượng senegenin trong dược liệu Viễn Chí 38

4.4.3.2 Kết quả định lượng 39

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Đề nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ctv : Cộng tác viên DĐVN : Dược điển Việt Nam DEPT : Distortionless Enhancement

by Polarization Transfer HMBC : Heteronuclear Multiple Quantum Correlation HSQC : Heteronuclear Single Quantum

HTLO : Hãi Thượng Lãn Ông

MS : Mass Spectroscopy NMR : Nuclear Magnetic Resonance

OD : Optical density

Rf : Ratio of flow SKLM : Sắc ký lớp mỏng

UV : Ultraviolet UV-Vis : Ultraviolet-visible

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Các thông số cột sắc ký (pha thuận) 22

Bảng 3.2 Kiểm tra các phân đoạn cột sắc ký 23

Bảng 3.3 Dung dịch chuẩn senegenin với 6 nồng độ khác nhau 24

Bảng 4.1 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của bột dược liệu Viễn Chí 26

Bảng 4.2 Kết quả độ ẩm mẫu bột dược liệu Viễn Chí mua tại HTLO 27

Bảng 4.3 Kết quả độ ẩm mẫu cao dược liệu Viễn chí mua tại HTLO 27

Bảng 4.4 Kết quả độ tro toàn phần mẫu bột dược liệu Viễn Chí 28

Bảng 4.5 Kết quả độ tro toàn phần mẫu cao dược liệu Viễn Chí 28

Bảng 4.6 Kết quả độ tro không tan trong acid của mẫu bột dược liệu Viễn Chí 29

Bảng 4.7 Phản ứng hóa học của nguyên liệu Viễn Chí 29

Bảng 4.8 KL cao phân đoạn thu được bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng 31

Bảng 4.9 Thông số phổ 1H, 13C, DEPT, COSY, HMBC của SP 34

Bảng 4.10 Giá trị OD dung dịch chuẩn với 6 nồng độ khác nhau 38

Bảng 4.11 Hàm lượng senegenin trong dược liệu Viễn Chí 39

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Rễ Viễn Chí (Radix Polygala tenuifolia Willd) 3

Hình 2.2 Công thức hóa học của Saponin 5

Hình 2.3 Công thức hóa học của Xanthone 5

Hình 2.4 Cấu trúc của 3 Saponin 6

Hình 2.5 Phân loại Saponin 8

Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình thực hiện nghiên cứu 16

Hình 3.2 Phân tích sơ bộ các thành phần hóa thực vật bằng các phản ứng hóa học 17

Hình 3.3 Sắc ký đồ các cao phân đoạn của cột sắc ký (CHCl3:MeOH (9:1)) 22

Hình 3.4 Quy trình định lượng hàm lượng senegenin trong Viễn Chí 25

Hình 4.1 Phản ứng hóa học của Viễn Chí 29

Hình 4.2 Sắc ký đồ các cao phân đoạn của Viễn Chí (CHCl3:MeOH (9:1)) 31

Hình 4.3 Quy trình chiết xuất dược liệu Viễn Chí 32

Hình 4.4 Chiết xuất và phân lập cấu trúc Sapogenin 33

Hình 4.5 Sắc ký đồ SP so với cao ethyl acetate 33

Hình 4.6 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của SP trên 3 hệ dung môi 34

Hình 4.7 Tương quan HM1BC, COSY của SP 36

Hình 4.8 Cấu thức cấu tạo của Senegenin 37

Hình 4.9 Đỉnh hấp thu cực đại của chuẩn Senegenin tại bước sóng 210 nm 38

Hình 4.10 Đường chuẩn phương trình hồi quy và R2 39

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Bên cạnh những tiến bộ vượt bậc của y học hiện đại trong việc chăm sóc sức khỏe con người, y học cổ truyền cũng nắm giữ một vai trò không nhỏ trong đời sống của người Việt Nam từ xưa đến nay Từ lâu, người ta đã biết sử dụng các loài cây cỏ như một loài thảo dược để chữa bệnh, nhưng đa phần các bài thuốc này đều dựa trên kinh nghiệm của người xưa là chính Ngày nay, với sự tiến bộ không ngừng của khoa học, con người đã phân lập được rất nhiều hợp chất từ cây cỏ và hiểu rõ hơn về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của các hợp chất này Cùng với thời gian, đông y Việt Nam ngày càng phát triển, thị trường mua bán thuốc đông dược cũng mở rộng hơn Hiện nay, thị trường đông dược Việt Nam khá lớn, trải dài từ Bắc đến Nam, đa dạng phong phú về các loại hình sản phẩm, tuy nhiên, chất lượng và nguồn gốc của thuốc cũng hết sức đa dạng, trở thành vấn đề bức xúc của xã hội trong thời gian gần đây; mặt trái của kinh doanh mua bán thuốc, thực trạng thị trường đông dược trên cả nước hết sức phức tạp, thị trường dược liệu Việt Nam đang có xu hướng trở thành nới tiêu thụ thứ phẩm và phế phẩm của thị trường đông dược nước ngoài Vấn đề đặt ra là cần kiểm tra xác định thành phần hóa học và tác dụng sinh học, góp phần vào tiêu chuẩn hóa , kiểm tra chất lượng nguyên liệu, cây thuốc đang lưu hành hiện nay

Theo y học cổ truyền, Viễn Chí có nhiều tác dụng sinh học như: an thần, khử đàm khai khiếu, tiêu ung thủng, trị chứng hồi hộp, mất ngủ, tâm thận bất giao, đàm trở tâm khiếu, động kinh, hàn đàm khái thấu, ung nhọt sưng…Uống với liều thích hợp Saponin có trong Viễn Chí sẽ kích thích bài tiết niêm dịch ở khí quản, có tác dụng chữa ho, long đờm, kích thích sự bài tiết nước bọt, bài tiết các tuyến ở da và thông tiểu Viễn Chí có tác dụng tiêu viêm, ngoài ra còn có tác dụng an thần, nâng cao trí lực (Ngô Văn Thu, 1998) Tại Việt Nam, các nghiên cứu về Viễn Chí hiện nay còn rất ít

Đề tài “Tách chiết, xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất chính trong Viễn

Chí (Polygala tenuifolia Willd), góp phần xây dựng tiêu chuẩn, kiểm nghiệm dược

liệu này trên thị trường” đã được thực hiện nhằm đáp ứng nhu cầu xã hội và làm tiền

đề, định hướng cho các nghiên cứu khác trên đối tượng này

1.2 Yêu cầu

Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc hợp chất chính (dự đoán là Saponin) trong thành phần cao chiết dược liệu Viễn Chí, góp phần xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu này trên thị trường

1.3 Nội dung thực hiện

a Bước đầu tiêu chuẩn hóa dược liệu Viễn Chí gồm:

- Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của dược liệu Viễn Chí theo quy trình của trường Đại học Dược Khoa Rumani

- Thử độ tinh khiết của nguyên liệu: độ ẩm, độ tro toàn phần, độ tro không tan trong acid

- Đánh giá chất lượng nguyên liệu về mặt định tính bằng phản ứng hóa học

b Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc hợp chất chính (dự đoán là Saponin) trong thành phần cao chiết dược liệu Viễn Chí

- Chiết xuất dược liệu Viễn Chí và tiến hành thu cao phân đoạn: ether dầu, ethyl acetate, n-butanol, nước

- Tiến hành sắc ký cột trên cao phân đoạn để thu nhận các hợp chất chính

- Áp dụng kĩ thuật về phổ NMR, MS xác định cấu trúc hợp chất phân lập được

- Định lượng: hàm lượng senegenin trong nguyên liệu Viễn Chí theo phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis)

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan dược liệu Viễn Chí

Dược liệu Viễn Chí hiện nay nước ta còn đang nhập nội Nó là rễ phơi khô của

cây Viễn Chí Siberi tức Viễn Chí lá trứng (Polygala sibirica L ) hoặc của cây Viễn Chí lá nhỏ (Polygala tenuifolia Willd)

Hình 2.1 Rễ Viễn Chí (Radix Polygala tenuifolia Willd)

Tên khác: Nam Viễn Chí , Tiểu Thảo

Tên khoa học: Polygala tenuifolia Willd

Hiện nay có 15 chi và 900 loài, phân bố gần như khắp thế giới Ở Việt Nam có khoảng 5 chi và 40 loài

- Giới thực vật

- Ngành Magnoliophyta

- Lớp Magnoliopsida

- Bộ Đậu (Fabales)

- Họ Viễn Chí (Polygalaceae)

- Chi Polygala

2.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố

Viễn Chí lá nhỏ (Polygala tenuifolia Willd) thuộc loài thân thảo Từ gốc của cây

mọc lên nhiều thân nhỏ, không có lông tơ Lá mọc so le, không có cuống, phiến lá hẹp Hoa mọc thành chùm, đài không đều, 5 lá đài có hai lá bên phát triển thành cánh, 3 cánh hoa màu xanh dính lại thành ống không đều, 8 nhị dính liền thành một bó Bầu trên có 2 ô, quả nang

Loài Viễn Chí lá nhỏ mọc ở xung quanh hồ Baican, đông Siberi Ở Trung Quốc thì có ở miền bắc và đông bắc Hiện nay nước ta vẫn nhập Viễn Chí của Trung Quốc

Nước ta cũng có nhiều loài Viễn Chí nhưng ít được sử dụng như: P.cardiocarpa Kurz (Viễn Chí quả hình tim) có mọc ở Bà Rịa – Vũng Tàu, Đồng Nai; P.tokinensis Chodat

(Viễn Chí miền Bắc) có mọc ở Hà Tây, Ninh Bình…

2.1.3 Đặc điểm dược liệu Viễn chí

2.1.3.1 Mô tả thực vật rễ Viễn Chí

Rễ đã bỏ lõi gỗ từng ống hoặc từng mảnh, thường cong queo, dài 5 – 15 cm, đường kính 0,3 – 0,8 cm, đầu rễ có khi còn sót phần gốc thân, mặt ngoài màu xám hoặc tro, có những nếp nhăn, đường nứt ngang và dọc nhỏ Mặt cắt ngang có lớp vỏ màu nâu nhạt, ruột rỗng (đã bỏ gỗ) Đối với rễ chưa bỏ lõi gỗ, khi cắt ngang thấy lớp

gỗ trắng xám và có chỗ rách Lớp vỏ dễ tách khỏi gỗ Vị đắng, hơi cay

2.1.3.2 Vi phẫu rễ Viễn Chí

Rễ đã bỏ lõi gỗ: lớp bần có khoảng 10 hàng tế bào Tế bào mô mềm vỏ chứa nhiều giọt dầu, đôi khi chứa tinh thể calci oxalat hình lăng trụ Trong mô mềm có những chỗ rách ngang Tế bào libe nhỏ nhăn nheo, ở gần tầng phát sinh gỗ có nhiều chỗ rách nằm theo hướng xuyên tâm Rễ chưa bỏ lõi có phần gỗ tạo bởi vòng ống mạch, sợi gỗ và mô mềm gỗ, tia ruột gồm 1 – 3 dãy tế bào

2.1.3.3 Bột dược liệu rễ Viễn Chí

Bột màu nâu nhạt Soi kính hiển vi thấy: mảnh bần màu vàng nâu nhạt Nhiều mảnh mô mềm tế bào dài hoặc hơi tròn chứa nhiều giọt dầu Có những giọt dầu đứng riêng lẻ Mảnh ống mạch, mạch vạch, đôi khi kèm theo sợi gỗ Nếu bỏ hết lõi gỗ thì không thấy mảnh mạch ở bột

2.1.4 Thành phần hóa học của rễ Viễn Chí

Saponin của Viễn Chí thuộc loại Saponin triterpenoid nhóm olean Các thành phần trước đây xác định có trong một số loại Viễn Chí như: segenin (acid tenuifolic), acid segenic, hydroxysegenic đều là những chất giả tạo Chất Saponin thật được xác định là presegenin Một monosid của presenegin là prosenegin (tenuifolin) cũng được xác định từ Viễn Chí lá nhỏ (Ngô Văn Thu, 1998; Đỗ Huy Bích, 2004)

Hình 2.2 Công thức hóa học của Saponin (Ngô Văn Thu, 1998)

Trong Viễn Chí lá nhỏ còn có chất kiềm hữu cơ là tenuidin và một đường polygalitol (1,5 anhydrosorbitol) Từ dịch chiết ether người ta đã tách thêm được 3 dẫn xuất Xanthol: 1,2,3,7-tetra methoxylxanthol (I) 1,2,3,6,7-pentamethoxylxanthon (II) 6- hydroxyl 1,2,3,7- tetramethoxylxanthol (III) và dẫn chất 3,4,5- trimethoxycinnamic acid (IV)

Hình 2.3 Công thức hóa học Xanthon (Ngô Văn Thu, 1998)

Từ rễ loài senega Brieskom và ctv đã phân lập và xác định 8 Saponin có aglycon

là presenegin và tỉ lệ giữa các đường glucose, galactose, xylose, fuctose và rhamnose

là 3,1,2,1,1;2,1,1,1,1; 2,1,1,1,1;3,1,1-;3, -1,1,1; 3,1,1,1,2; 1,1,1,1,1; 3,1,6,-,1 Năm

1971, Shoji và ctv xác định cấu trúc của 3 Saponin:

Hình 2.4 Cấu trúc của 3 Saponin (Shoji và ctv, 1971)

 Tenuigenin A, B (Chou T Q và ctv, 1947)

 Tenuifolin (Pelletier S W và ctv, 1971)

 Onjisaponin A, B, C, D, E, F, G (Sakuma S và ctv, 1981)

 Tenuifoliside A, B, C, D và a-D- (3-O-Sinapoyl) – Fructofuranosyl-a-D- (6-O-

Sinapoyl) –Glucopyranoside (Ikeya Y và ctv, 1991)

 Tenuifoliose A, B, C, D, E, F (Miyase Y và ctv Chem Pharm Bull, 1991)

Những nghiên cứu gần đây cho thấy trong cây Viễn Chí có chứa các hợp chất như lignan, coumarin, xanthon, flavonoid (Hishashi Matsuda, 2003)

2.1.5 Tính dược lý của Viễn Chí

- Uống với liều thích hợp Saponin có trong dược liệu sẽ kích thích sự bài tiết niêm dịch ở khí quản, có tác dụng chữa ho, long đờm, kích thích sự bài tiết nước bọt, bài tiết các tuyến ở da và thông tiểu

- Có tác dụng tiêu viêm, an thần, nâng cao trí lực

- Toàn bộ Viễn Chí gây ngủ và chống co giật

- Chất Senegi có tác dụng tán huyết, phần vỏ mạnh hơn phần gỗ, Viễn Chí có tác dụng hạ áp

- Tác dụng kháng khuẩn: ức chế sự phát triển của các vi khuẩn Staphylococcus

aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus hemolyticus, Diplococcus pneumoniae

- Độc tính: Liều độc LD50 của vỏ rễ Viễn Chí cho chuột nhắt uống là 10,03 ± 1,98 g/kg Liều LD50 toàn rễ là 16,95 ± 2,01 g/kg mà rễ bỏ lõi gỗ đi dùng đến 75 g/kg thì gây tử vong

2.1.6 Tính vị, công năng của Viễn Chí

Viễn Chí có vị hắc, đắng, the, tính hơi ấm, vào 2 kinh tâm và thận, có tác dụng an thần, ích trí, khu đàm, chỉ khái, ích tinh, hoạt huyết, tán ứ, tiêu thũng, giải độc

2.1.7 Công dụng của Viễn Chí

Viễn Chí được dùng để chữa ho, nhiều đờm, viêm phế quản, hay quên, giảm trí nhớ, liệt dương, yếu sức, mộng tinh, bổ cho nam giới và người già, thuốc làm sáng mắt, thính tai do tác dụng trên thận Ngoài ra, Viễn Chí còn chữa đau tức ngực, lao, ngủ kém, suy nhược thần kinh, ác mộng

Dùng ngoài, Viễn Chí phơi khô tán bột, tẩm nước, đắp chữa đòn ngã tổn thương, mụn nhọt, lở loét, sưng và đau vú, rắn độc cắn

2.2 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước của Polygala tenuifolia Willd

2.2.1 Trên thế giới

Năm 1996, tại Nhật Bản, các nhà khoa học công bố kết quả nghiên cứu về hiệu

quả hạ đường huyết của thân rễ Polygala tenuifolia được thử nghiệm trên chuột bình thường và mắc bệnh tiểu đường Tác dụng hạ đường huyết của Polygala tenuifolia xảy

ra mà không làm thay đổi nồng độ insulin Một trong những thành phần chính gây ra hiệu ứng hạ đường huyết là glycosid triterpen senegin-II (Kako và ctv, 1996)

Năm 2006, tại Trung Quốc, các nhà khoa học công bố kết quả nghiên cứu

Polygala tenuifolia Willd có khả năng tăng cường chức năng tế bào lympho gây ra bởi

Cyclophosphamide trên chuột (De-zhong và ctv, 2006) Một nghiên cứu khác về tác

dụng chống trầm cảm của 3’,6’- Disinapoyl sucrose từ Polygala tenuifolia Willd

Nghiên cứu này tiến hành kiểm tra nhận thức trên chuột thử nghiệm độc tính Hydroxytrytophan và yohimbin Kết quả cho thấy chuột tăng đáng kể triệu chứng đầu

5-co giật (Liu Ping và ctv, 2008) Một nghiên cứu khác về tác dụng của Senegenin được thử nghiêm trên chuột Senegenin đóng vai trò bảo vệ thần kinh trong HIR (hepative ischemia-reperfusion) thông qua việc tăng biểu hiện vùng đồi thị NR2B của chuột Phát hiện này cho thấy rằng senegenin có thể là một tác nhân tiềm năng để phòng ngừa

và điều trị rối loạn chức năng nhận thức sau phẫu thuật hoặc các bệnh thoái hoá thần kinh khác (Xie và ctv, 2012)

2.2.2 Việt Nam

Tại Việt Nam chưa có nhiều chương trình nghiên cứu và ứng dụng, Viễn Chí chỉ được sử dụng trong y học dân gian để chữa ho có đờm, suy nhược, lo âu, mất ngủ (Nguyễn Đức Nghĩa, 2010)

2.3 Tổng quan về hợp chất Saponin

2.3.1 Định nghĩa và phân loại

Hình 2.5 Phân loại Saponin (Ngô Văn Thu, 1990)

Saponin còn gọi là saponosid có nguồn gốc từ chữ La tinh là “Sapo” nghĩa là xà phòng Saponin là một glycosid gồm hai phần: phần đường và không đường gọi là aglycon hay sapogenin Về phần đường: phổ biến nhất là D-Glucoga, D-Galactoga, L-Arabioga, L-Rammoga…Về phần Sapogenin, dựa vào cấu trúc hóa học có thể chia làm hai nhóm lớn là Triterpenoid và Steroid Saponin triterpenoid thì có loại trung tính

và loại acid, Saponin steroid thì có loại trung tính và loại kiềm

2.3.2 Tính chất của Saponin

Saponin là một glycosid phân bố rộng trong thực vật, có các tính chất đặc trưng:

- Khi hòa vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt, có thể giải thích là do Saponin có phần ưa nước và kỵ nước Tính chất này làm Saponin giống với xà phòng: có tính nhũ hóa và tẩy sạch (Ngô Văn Thu, 1990)

- Saponin làm vỡ hồng cầu ngay ở nồng độ rất loãng – tính phá huyết Tính phá huyết có liên quan đến sự tạo phức giữa Saponin với cholesterol và các ester của

Saponin

Saponin triterpenoid (30C) Saponin steroid

Pentacyclic Tetracyclic 1 Spirostan

cholesterol trong màng hồng cầu, nhưng lại thấy có nhiều trường hợp chỉ số phá huyết

và khả năng phá huyết không tỉ lệ thuận với nhau nên phải xét đến ảnh hưởng của Saponin trên các thành phần khác của màng hồng cầu Qua việc theo dõi tính phá huyết, người ta thấy rằng cấu trúc của phần aglycon tác dụng trực tiếp đến tính phá huyết còn phần đường ảnh hưởng tới mức độ phá huyết Hồng cầu của các động vật khác nhau bị ảnh hưởng khác nhau đối với một loại Saponin (Ngô Văn Thu, 1990)

- Thường ở dạng vô định hình, có vị đắng, khó tinh chế, có điểm nóng chảy thường cao từ 200oC trở lên và có thể hơn 300oC; tan trong nước, cồn, rất ít tan trong aceton, eter, hexan…

- Bị tủa bởi acetat chì, hydroxid barium, sulfat amonium…có thể lợi dụng tính chất này để cô lập Saponin

- Độc với cá vì Saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra còn có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên

- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu; nếu sử dụng liều cao gây nôn mửa, đi lỏng

Tuy vậy, một vài tính chất trên không thể hiện ở một vài Saponin Ví dụ: sarsaparillosid thì không có tính phá huyết cũng như tính tạo phức với cholesterol Saponin đa số có vị đắng trừ một số như glycyrhixin có trong cam thảo bắc,

abrusosid trong cam thảo dây, oslandin trong cây Polypodium vulgare có vị ngọt

2.3.3 Hoạt tính của Saponin

Kháng khuẩn, kháng nấm và kháng viêm Saponin nhóm spirostan gồm nhiều hoạt chất có tính kháng ung thư Các glycosid spirostanol chứa trên bốn đơn vị đường thì thấy có tác dụng chống ung thư rõ rệt Tác dụng hướng sinh dục, tác dụng lên hê thần kinh, tác dụng lên động vật máu lạnh và côn trùng được ứng dụng để chống mối, làm liệt giun… tổng hợp nội tiết tố: Saponin steroid được dùng để tổng hợp các nội tiết

tố steroid như testosteron, progesteron, cortison (Ngô Văn Thu, 1990)

2.3.4 Sự phân bố trong thực vật

Saponin steroid thường gặp trong những cây một lá mầm Các họ hay gặp là: Amaryllidaceae, Dioscoreaceae, Liliaceae, Smilacaceae Đáng chú ý nhất là một số loài thuộc chi Dioscorea L.; Agave L.; Yucca L…

Saponin triterpenoid thường gặp trong những cây hai lá mầm thuộc các họ: Acanthaceae, Amaranthaceae, Araliaceae, Campanulaceae, Caryophyll-aceae, Fabaceae Trong cây Saponin thường tích lũy ở những bộ phận khác nhau như: tích lũy ở quả Bồ Kết, Bồ Hòn; rễ Cam Thảo, Viễn Chí, Cát Cánh; lá Dứa Mỹ…

2.4 Phương pháp phân lập các hợp chất hữu cơ

2.4.1 Các kỹ thuật chiết tách các hợp chất ra khỏi cây

Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng-lỏng và chiết rắn lỏng Trong thực nghiệm, sự chiết rắn lỏng được thực hiện nhiều hơn, gồm sự ngấm kiệt (percolation),

sự ngâm dầm (maceration), sự trích với máy chiết Soxhlet… Sự chiết bằng cách nấu nguyên liệu cây với nước còn được gọi là nước sắc Ngoài ra, còn có sự chiết với phương pháp lôi cuốn bằng hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn…

2.4.1.1 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt

Bột cây được xay thô, lọc qua lỗ rây 3 mm Mẫu không nên to hơn vì sẽ chiết không kiệt, mẫu không được xay quá mịn hoặc mẫu có tính nhầy nhựa hoặc tính trương nở…sẽ cản trở dòng chảy Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc Bột cây được đặt vào bình, bên trên lớp bông thủy tinh, lên gần đầy bình Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột Từ từ rót dung môi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt Có thể dùng dung môi nóng hoặc nguội

Để yên sau một thời gian, thường là 12 - 24 giờ Mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt nhanh và đồng thời mở khóa bình lóng để dung môi tinh khiết chảy xuống bình ngấm kiệt Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chạy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này Kiểm tra việc chiết kiệt mẫu bột cây bằng sắc ký lớp mỏng hoặc nhỏ một giọt dung dịch chiết lên tấm kiếng sạch, để bốc hơi và xem còn để lại vết gì trên mặt kiếng hay không, nếu không còn vết gì là đã chiết kiệt

2.4.1.2 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng

Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi Cao alcol thô ban đầu (thí

dụ bột cây được tận trích với metanol 80%, đuổi dung môi thu được cao ancol thô ban đầu) hoặc dung dịch ban đầu (thí dụ dung dịch sinh học) đều chứa hầu hết các hợp

chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập được riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng được

áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (eter dầu hỏa…) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực (các alcol béo, ester béo…), dung môi phân cực trung bình (dietyl eter, cloroform…) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình (các hợp chất có chứa nhóm chức eter –O–, aldehyd –CH=O, ceton –CO–, ester –COO–…) và dung môi phân cực mạnh (metanol…) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức –OH, –COOH …)

Cần lưu ý rằng sự chiết lỏng – lỏng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nếu gia tăng nhiệt độ cho dung môi thì khả năng hòa tan của dung môi sẽ tăng lên

2.4.2 Sắc ký

Sắc ký là một phương pháp vật lý nhằm mục đích tách riêng các cấu tử của một hỗn hợp nhờ vào sự phân chia của các cấu tử này giữa 2 pha (pha tĩnh và pha động), trong đó pha động xuyên qua pha tĩnh theo một hướng nhất định

Có thể phân loại các phương pháp sắc ký dựa vào:

Pha động (khí, lỏng siêu tới hạn, lỏng)

Cơ chế tách (hấp phụ, phân bố, rây phân tử, trao đổi ion…)

Nguyên tắc: một dung dịch mẫu thử được chấm lên một lớp mỏng chất hấp phụ trán trên nền phẳng đóng vai trò là pha tĩnh Một dung môi khai triển di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử theo một vận tốc khác nhau tạo thành một sắc đồ gồm nhiều vết có Rf khác nhau

Với chất hấp thu là silica gel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ di chuyển nhanh và các hợp chất phân cực mạnh sẽ di chuyển chậm

Sắc kí lớp mỏng có ưu điểm: sử dụng ít chất hấp thu, cần rất ít mẫu phân tích (vi lượng), quá trình triển khai sắc ký nhanh nên trong một thời gian ngắn có thể biết ngay kết quả mẫu cần phân tích có chứa bao nhiêu chất khác nhau

sẽ được rót liên tục vào đầu cột Nhờ trọng lực, dung môi khai triển di chuyển từ trên đầu cột xuống dưới cột, xuyên ngang qua pha tĩnh, làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử, do các cấu tử này có độ phân cực khác nhau nên ái lực của chúng đối với pha tĩnh cũng khác nhau, vì vậy chúng sẽ bị dung môi giải hấp và bị đẩy đi với các vận tốc khác nhau, tạo thành các băng khác nhau, ra khỏi cột tại các thời điểm khác nhau, dung môi ra khỏi cột được hứng thành những phân đoạn trong các ống nghiệm, mỗi ống nghiệm với mỗi thể tích như nhau Các phân đoạn được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng và những phân đoạn giống nhau được gộp chung, loại dung môi để thu được chất tinh khiết Áp lực đẩy dòng dung môi qua cột là áp lực thủy tĩnh

Trang bị cho sắc ký cột cổ điển rất đơn giản, không tốn kém nên hiện nay vẫn là phương tiện chủ yếu để tách các chất có trong thành phần hóa học của dược liệu

2.5 Phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc của hợp chất hữu cơ

Việc xác định cấu trúc của một hợp chất như thế được dựa vào các phương pháp hóa lí như điểm chảy, năng lực triền quang, MS, IR, NMR, UV…rất cần thiết trong

quá trình trích ly cô lập các hợp chất mới từ dược liệu

Phổ MS cung cấp các thông tin về kích thước, công thức nguyên của phân tử Phổ IR cung cấp thông tin về các nhóm định chức Phổ NMR giúp thấy rõ hơn về khung sườn carbon – hydrogen của hợp chất cần khảo sát Phổ UV-Vis chỉ được sử dụng khi phân tử chứa một hệ nhiều nối đôi liên hợp và được ứng dụng rộn rãi để phân

tích định lượng…Mẫu phải đạt được từ 95% trở lên về độ tinh khiết thì mới đủ tiêu chuẩn đo phổ

2.6 Phương pháp quang phổ hấp thu tử ngoại và khả kiến (UV-Vis)

2.6.1 Khái niệm

Phổ tử ngoại -khả kiến là các dạng của bức xạ điện từ, có bản chất là sóng điện

từ, chúng chỉ khác nhau về độ dài sóng Vùng tử ngoại - khả kiến bao gồm các bức xạ điện từ có độ dài sóng trong khoảng 200 - 800nm (vùng khả kiến 360 - 800)

Khi phân tử hấp thụ bức xạ tử ngoại khả kiến phụ thuộc vào cấu trúc tử ngoại hoặc khả kiến thì những electron hoá trị của nó bị kích thích và chuyển từ trạng thái cơ bản lên trang thái khích thích Sự hấp thụ bức xạ của phân tử được ghi lại, phổ thu được gọi là phổ tử ngoại - khả kiến và cũng được gọi phổ hấp thụ electron

- Hoạt động của vùng tử ngoại khả kiến:

Vùng tử ngoại - khả kiến bao gồm các bức xạ điện từ có độ dài sóng trong khoảng 200 - 800 nm (vùng khả kiến 360 - 800nm) Sự hấp thụ có nhiều ứng dụng trong quang phổ tử ngoại là trong vùng 200-380 nm, gọi là vùng tử ngoại gần

Trên phổ tử ngoại các vị trí băng hay còn gọi là dải hấp thụ được đo bằng độ dài sóng , đơn vị là nanomet (nm) hoặc Angstron (Ao) Cường độ tia đơn sắc trước và sau khi đi qua môi trường hấp thụ được liên hệ với nhau bởi định luật Lambert -Beer Khác với vùng phổ hồng ngoại, ở vùng phổ tử ngoại - khả kiến , định luật Lambert-Beer được tuân theo tốt hơn nhiều, do đó thường được xác định chính xác và

có tính lặp lại

Phổ tử ngoại – khả kiến ( Phổ UV-Vis) thường cho ta đường cong phụ thuộc độ hấp thụ A ( lg (I0/I) ) vào bước sóng  Theo định luât Lambert - Beer mật độ quang phụ thuộc vào nồng độ của chất hấp thụ

Phương trình của định luật cơ bản hấp thụ ánh sáng Bo Rugher - Lambert - Beer:

I = Io10-ɛlC hay A = ɛlC

Trong đó: I và Io là cường độ dòng sáng lúc đầu và lúc sau

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: bắt đầu từ ngày 15/12/2012 đến ngày 30/06/2013

- Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Sâm và Dược liệu TP Hồ Chí Minh, số 41 Đinh Tiên Hoàng, Quận 1, TP Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

3.2.1 Nguyên liệu

Dược liệu Viễn Chí (Polygala tenuifolia Willd) được thu mua tại chợ Hải

Thượng Lãn Ông, Tp Hồ Chí Minh Nguyên liệu được phơi khô và xay thành bột, bảo quản ở nhiệt độ phòng tại trung tâm Sâm và Dược liệu

3.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

 Thiết bị dụng cụ

- Đèn UV 2 bước sóng, máy quang phổ tử ngoại

- Tủ sấy đảm bảo điều chỉnh nhiệt độ (103 ± 2oC) hiệu SANYO MOV-112

- Lò nung điều chỉnh được nhiệt độ 525 ± 25oC hiệu LENTON FURNACES, Made in England

- Bể siêu âm Sonorex RK-1028H (Bandelin)

- Máy cô quay BUCHI-114 (Thụy Sỹ)

- Máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến Unicam, HE λ 10 SY Themor Spectrorius

- Phổ NMR được đo tại khoa Hóa – Trường đại học khoa học tự nhiên TP HCM

 Hóa chất – thuốc thử

- Các hóa chất dùng cho chiết xuất: methanol, ether dầu, ethyl acetate; n-butanol

- Các dung môi khai triển sắc ký: diethyl ether, chloroform, ethyl acetate, methanol …

- Các thuốc thử Fehling, Mayer, Dragendoff, Bouchardat, Folin Ciocalteur

- Bản mỏng tráng sẵn (Silica gel – Merck)

- Silica gel hạt vừa (Merck, cỡ hạt 40 – 63 µm)

- Ngoài ra còn có các hóa chất khác: NH4OH, FeCl3, HCl, H2SO4, KOH, Na2SO4, CdCl3

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình thực hiện nghiên cứu 3.3.1 Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu

3.3.1.1 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của cao chiết Viễn Chí

Dựa vào độ hòa tan của các hợp chất trong dược liệu, chiết tách hỗn hợp với các dung môi theo độ phân cực tăng dần: kém phân cực, phân cực trung bình và phân cực mạnh Bằng cách chiết nguyên liệu lần lượt với các dung môi: diethyl ether, ethanol và nước (Trần Hùng, 2006) Sau đó, xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng phản ứng đặc trưng theo hình 3.2

 Chuẩn bị dịch chiết

- Chiết dịch chiết ether

Chiết 10 g cao tổng (ethanol) trong bình nón (khoảng 3 lần x 30 ml) bằng diethyl ether trong bể siêu âm khoảng 20 phút/lần Chiết cho đến khi dịch ether sau khi bốc hơi không còn để lại lớp cắn mờ trên mặt kính đồng hồ Gộp dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50 ml dịch chiết ether

Bước đầu xây

Cao Ether Cao Ethyl acetate Cao n-butanol

Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột cổ điển, định lượng hợp chất phân lập được

Hình 3.2 Phân tích sơ bộ các thành phần hóa thực vật bằng các phản ứng hóa học

Alkaloid Thuốc thử chung Coumarin Phát huỳnh quang/OH-Flavonhoid Phản ứng Cyanidin Anthocyanidin HCl đậm đặc Proanthocyani

din HCl, gia nhiệt  tủa đỏ Tannin FeCl3 5%, gelatin muối Saponin

Phản ứng Burchard và tính tạo bọt trong nước

Lieberman-Acid hữu cơ Na2CO3 sủi bọt Hợp chất khử Thuốc thử Fehling

Acid béo Mờ giấy lọc Tinh dầu Cắn có mùi thơm Carotenoid Phản ứng Carr – Price Tritepenoid

TD

Phản ứng Lieberman–Burchard

Coumarine Phát huỳnh quang Alkaloid Thuốc thử chung Anthraquinon Phản ứng Borntrager Flavonoid Phản ứng Cyanidin

Alkaloid Thuốc thử chung Flavonhoid Phản ứng Cyanidin Anthocyanidin HCl đậm đặc Proanthocyani

din HCl, gia nhiệt  tủa đỏ Tannin FeCl3 5%, gelatin muối Saponin

Phản ứng Burchard và tính tạo bọt trong nước

Lieberman-Acid hữu cơ Na2CO3 sủi bọt Hợp chất khử Thuốc thử Fehling Polyuronic Pha loãng trong cồn > tủa

- Chiết dịch chiết cồn

Bã dược liệu sau khi chiết bằng ether được chiết tiếp bằng cồn cao độ, chiết nóng trong bể siêu âm (khoảng 3 lần x 30 ml, 20 phút/lần) Gộp dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50 ml dịch chiết cồn

Lấy 15 ml dịch chiết cồn cho vào bình nón 100 ml, thêm 10 ml acid hydrocloric 10% và đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30 phút Để nguội cho hỗn hợp vào bình lắng gạn và chiết bằng ether ethylic (15ml x 3 lần) Dịch ether được dùng để định tính các aglycon sau khi thủy phân

- Chiết dịch chiết nước

Bã dược liệu sau khi chiết bằng cồn được chiết nóng bằng nước trong bình nón trên bếp cách thủy sôi Gộp các dịch chiết để nguội, lọc (và cô lại nếu cần) để có 50ml dịch chiết nước

Lấy 15 ml dịch chiết nước cho vào bình nón 100 ml, thêm 10 ml aicd hydrocloric 10% và đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30 phút Để nguội cho hỗn hợp vào bình lắng gạn và chiết bằng ether ethylic (15 ml x 3 lần) Dịch ether được dùng để định tính các aglycon

3.3.1.2 Khảo sát độ tinh khiết của nguyên liệu

 Xác định độ ẩm bột dược liệu – cao tổng

- Cân trọng lượng bì

- Cân chính xác mẫu vào bì

- Sấy mẫu ở áp suất thường, 105oC trong 4 giờ, lấy ra để trong bình hút ẩm và đem cân trọng lượng sau khi sấy Ghi lại lượng cân

- Tiếp tục sấy mẫu ở áp suất thường, 105oC trong 2 giờ, để vào bình hút ẩm chờ nguội và cân lại trọng lượng sau khi sấy Lặp lại nhiều lần, mỗi lần sấy 2 giờ, cho đến khi khối lượng không thay đổi

- Độ ẩm của mẫu được tính theo công thức sau:

  X: độ ẩm mẫu thử (%)

  a: khối lượng ban đầu của mẫu thử (g)

b: khối lượng sau cùng của mẫu thử (g)

c: khối lượng bì (g)

Đánh giá kết quả: Dược liệu đạt yêu cầu khi độ ẩm không quá 14%

- Dùng kẹp sắt dài đưa chén vào lò nung ở 500 – 600oC cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen) Dùng kẹp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm Cân và ghi lại lượng cân

- Đặt chén đựng tro vào lò nung và tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ nữa Lấy chén ra, để nguội trong bình hút ẩm Cân

- Tiếp tục làm như vậy cho đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp, khối lượng chén tro không chênh lệch quá 0,5 mg

- Tro toàn phần được tính theo công thức:

A a b  x 100%

c c x hA%: tro toàn phần (%) của dược liệu

- Đánh giá kết quả: dược liệu đạt yêu cầu khi độ tro toàn phần không quá 6%

 Xác định độ tro không tan trong acid clohydric

- Lấy chén nung đã xác định tro toàn phần ở trên (chỉ thực hiện với bột dược liệu), thêm vào đó 25ml dung dịch acid hydrochlorid 2M (TT) Đậy chén bằng một mặt kính đồng hồ, đun sôi cẩn thận trong 5 phút Để nguội

- Lọc chất không tan bằng giấy lọc không tro Rửa giấy lọc và tro bằng nước cất nóng cho tới khi dịch lọc trung tính (thử bằng giấy quỳ)

- Cho tất cả giấy lọc và tro trở lại chén nung, sấy khô rồi đốt, nung ở 500 – 600oC đến khi khối lượng không đổi

- Nung tiếp cho đến khi giữa hai lần cân liên tiếp, khối lượng không chênh lệch nhau quá 1 mg

- Tính tỉ lệ phần trăm tro không tan trong acid với tro tan trong acid so với lượng mẫu đã sử dụng

- Độ tro không tan trong acid được tính theo công thức sau:

A a b  x 100%

c c x hA%: tro không tan trong acid (%) của dược liệu a: khối lượng chén có tro không tan trong acid

b: khối lượng chén không

c: khối lượng dược liệu dùng

h: độ ẩm (%) của dược liệu

- Đánh giá kết quả : dược liệu đạt yêu cầu khi độ tro không tan trong acid không quá 1,5%

3.3.1.3 Định tính hợp chất chính trong rễ Viễn Chí bằng phản ứng hóa học

- Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm 2 ml anhydrid acetic, lắc mạnh, để lắng 2 phút, lọc Lấy dịch lọc thêm 1 ml acid sulfuric để có hai lớp dung dịch phân tách rõ,

phần tiếp giáp giữa 2 dung dịch này sẽ hiện ra màu nâu đỏ rồi chuyển dần sang màu lục đen Dược điển Việt Nam IV

- Lấy 0,5 g bột dược liệu, cho vào ống có nút mài, thêm 10 ml nước nóng, duy trì

nhiệt độ khoảng 10 phút, lắc mạnh trong 1 phút, bọt hình thành bền ít nhất 10 phút

3.3.2 Phương pháp chiết xuất dược liệu và thu cao phân đoạn

3.3.2.1 Chiết xuất cao toàn phần

Thu cao toàn phần bằng phương pháp chiết ngấm kiệt, với dung môi chiết là ethanol (Trần Hùng, 2006; Nguyễn Thị Kim Phụng, 2007)

Tiến hành: 3 kg nguyên liệu khô được xay thô (mẫu cho lọt qua lỗ rây 3 mm) Làm ẩm bột với ethanol, rồi nạp mẫu vào bình ngấm kiệt đã lót sẵn bông ở đáy bình, vừa nạp vừa nén mẫu Phủ lên trên mẫu dược liệu một lớp giấy lọc và đặt những viên bi thủy tinh lên trên để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột Mở khóa rồi cho

từ từ ethanol vào bình ngấm kiệt đến khi có vài giọt dung môi bắt đầu chảy ra, khóa bình, đổ ngập dung môi cách mẫu dược liệu khoảng 5 - 6 cm Đậy kín để qua đêm

Mở vòi rút dịch chiết, gộp tất cả dịch chiết lại, cô giảm áp, thu được cao toàn phần (cao ethanol tổng) Viễn Chí

3.3.2.2 Chiết cao phân đoạn từ cao toàn phần

Cao ethanol tổng ban đầu chứa quá nhiều hợp chất từ không phân cực đến rất phân cực Áp dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng để phân chia cao tổng ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

Hòa cao tổng vào một lượng tối thiểu ethanol; sau đó rót dung dịch ethanol này vào một lượng lớn nước (tỷ lệ: 1:10) Lắc phân đoạn phần dịch này với các dung môi

có độ phân cực tăng dần: ether dầu, ethyl acetate, n-butanol Với mỗi loại dung môi hữu

cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết dung môi có tính phân cực hơn Thu các cao phân đoạn, cô giảm áp, ta thu được 4 loại cao: cao ether, cao Ethyl acetate, n-Butanol và phần dịch lắc còn lại sau cùng là cao nước (Ngô Văn Thu, 1998; Trần Hùng, 2006)

3.3.3 Khảo sát các cao phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng

Chuẩn bị dịch mẫu: mẫu được hòa tan trong methanol

Trước khi tiến hành chạy sắc ký cột đã thăm dò rất nhiều hệ pha động và đã tìm

ra hệ pha động chạy cho cột I (CHCl3:MeOH)

Các phân đoạn cột I được kiểm tra trên SKLM với dung môi khai triển CHCl3:MeOH (9:1), phun H2SO4 10% trong cồn, sấy ở 110oC trong 10 phút Phân đoạn cho những vết giống nhau được tập hợp lại thành phân đoạn lớn và đem cân lấy khối lượng