Bài viết có nội dung trình bày về phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hoạt chất kháng nấm có trong cao chiết từ lá trầu không. Nghiên cứu thực hiện sử dụng sắc ký cột với sự hỗ trợ của sắc ký lớp mỏng, kỹ thuật hiện hình sinh học, phương pháp khuếch tán và phương pháp pha loãng để xác định hoạt tính kháng nấm của hoạt chất.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HOẠT CHẤT KHÁNG NẤM CÓ TRONG CAO CHIẾT TỪ LÁ TRẦU KHÔNG Nguyễn Thu Gương*, Nguyễn Vũ Giang Bắc*, Lê Thị Lệ Uyên**, Nguyễn Đinh Nga* TÓM TẮT Mục tiêu: phân lập xác định cấu trúc hóa học hoạt chất kháng nấm có cao Trầu khơng Vật liệu phương pháp: Cao trầu không (cao TK): chiết xuất từ Trầu không thu hái Hóc Mơn, TP.HCM Cao TK cho tác động kháng nấm men, nấm da, số vi khuẩn Gram dương Gram âm Phương pháp phân lập hoạt chất kháng nấm từ cao TK: Sử dụng sắc ký cột với hỗ trợ sắc ký lớp mỏng, kỹ thuật hình sinh học, phương pháp khuếch tán phương pháp pha lỗng để xác định hoạt tính kháng nấm hoạt chất Kiểm tra độ tinh khiết xác định cấu trúc hóa học hoạt chất kháng nấm cao TK sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, khối phổ phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H NMR 13C NMR) Kết bàn luận: Đã phân lập xác định hoạt chất kháng nấm có cao TK hydroxychavicol Kết phù hợp với nghiên cứu trước hoạt chất cho tác động kháng nấm – kháng khuẩn có cao chiết từ Trầu không Ấn Độ, Mã lai,… Từ khóa: Cao Trầu khơng, hydroxy chavicol ABSTRACT ISOLATING AND DETERMINING CHEMICAL STRUCTURE OF ANTIFUNGAL PRINCIPLE AGENT IN BETLE EXTRACT Nguyen Thu Guong, Nguyen Vu Giang Bac, Le Thi Le Uyen, Nguyen Dinh Nga * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No - 2014: 235 - 239 Objectives: Isolation and determination of chemical structure of antifungal agent in the betle extract Material and methods: Betle extract was produced from leaves of Piper betle L Piperaceae, harvested in Hoc Mon, District 12, HCM city The antifungal agent in betle extract was isolated by column chromatography in support with thin layer chromatography (TLC), autobiography, disk diffusion and broth dilution method Chemical structure of the antifungal agent in betle extract were determined by using TLC, GC, GC-MS, 1H NMR and 13C NMR Outcome: The antifungal agent in betle extract was determined as hydroxy chavicol These results may be used in verify raw material and betle products Key words: Betle extract, hydroxy chavicol ĐẶT VẤN ĐỀ Trầu không (Piper betle L Piperaceae) trồng nhiều nơi Việt Nam Lá Trầu không dùng nhai với cau để làm răng, thơm miệng Ngoài ra, y học cổ truyền dùng Trầu khơng chữa cảm, giảm đau bong gân, làm lành vết thương, se niêm mạc, kích thích tiết men gan, làm lành vết thương, kích thích sinh * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh ĐT: 0908836969 Tác giả liên lạc: PGS TS Nguyễn Đinh Nga Chuyên Đề Dược Học Email: nganguyendinh@yahoo.com 235 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 dục, trị hắc lào, lang ben,… Trong số nghiên cứu nước Đông Nam Á Ấn Độ, Mã Lai, tác giả phân lập từ cao Trầu không, chiết với nước cồn ethyl hợp chất hydroxychavicol(Error! Reference source not found.), chứng minh hợp chất cho tác động kháng khuẩn, đặc biệt vi khuẩn gây hôi miệng, gây sâu răng(4); kháng Aspergillus, nấm da, C albicans, C glabrata(Error! Reference source not found.) kháng ung thư(1) Ở Việt Nam, cao chiết từ Trầu không tinh dầu Trầu không chứng minh kháng C albicans in vitro(3), Betelvine (cao chiết từ Trầu không) phối hợp với sucrategel cho hiệu giảm đau bệnh nhân viêm dày mạn tính có Helicobacter pylori(6) Nhằm tạo sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn cao trầu không, hướng ứng dụng làm thuốc kháng nấm, mục tiêu đề tài nhằm “Phân lập xác định cấu trúc hóa học hoạt chất kháng nấm có cao chiết từ Trầu không” VẬT LIỆU -PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Nguyên liệu Cao Trầu không Cao trầu không chiết xuất từ bột Trầu khơng thu hái Hóc Mơn, quận 12, TP HCM theo qui trình sau: Bột trầu ngâm lạnh với ethanol 96% theo tỷ lệ 1:10 24h Dịch chiết ethanol cô 40 oC với áp suất giảm đến khoảng 1/10 thể tích ban đầu Cao chiết 1:1 loại chlorophyll ether dầu hỏa lắc phân bố với dichloromethan, dịch chiết dichloromethan thu hồi dung mơi 50 oC để có cao Trầu không (cao TK) Cao TK chiết theo qui trình cho tác động kháng C albicans, Trichophyton mentagrophytes, T rubrum, T tonsurans, Microsporum gypseum, Malassezia furfur, với MIC từ 0,064–0,512 mg/ml Vi nấm sử dụng thí nghiệm: Candida albicans ATCC 10231 Phương pháp nghiên cứu 236 Phân lập hoạt chất kháng nấm có cao Trầu không Hoạt chất kháng nấm cao TK phân lập sắc ký cột Điều kiện sắc ký: Cột 30 cm x 0,5 cm; Chất hấp phụ: silica – gel G; cỡ hạt: 60 µm 10g hoạt hóa 105 oC/ ; Lượng mẫu: 0,6 g cao CH2Cl2 tương ứng với 30 g dược liệu khô; Dung môi khai triển CH2Cl2, CH2Cl2-EtOAc, MeOH; Tốc độ chảy: 11 giây/ giọt; Thể tích ống hứng: ml Gộp phân đoạn có tính chất sắc ký lớp mỏng, khảo sát tác động kháng nấm phương pháp khuếch tán kỹ thuật hình sinh học để xác định phân đoạn chứa hoạt chất kháng nấm cao Trầu khơng Kỹ thuật hình sinh học: Phân đoạn cho tác động kháng nấm từ sắc ký cột phân tách sắc ký lớp mỏng xác định vết sắc ký cho tác động kháng nấm Điều kiện thực hiện: Bản mỏng Silicagel F 254 (Merck), dày 0,25 mm, 20 x 20 cm; Dung môi khai triển: n- Hexan – EtOAc – MeOH (4: 2: 1); Phát vết cách soi UV bước sóng 254 nm 365 nm; Vi nấm thử nghiệm: Candida albicans ATCC 10231; Môi trường thử nghiệm: thạch Sabouraud Xác định mức độ tinh khiết hoạt chất kháng nấm sắc ký lớp mỏng chiều (Chiều 1: CH2Cl2 – EtOAc (8:2); Chiều 2: n-Hexan – Dietylete (4:6)); sắc ký khí phổ UV-Vis Xác định cấu trúc hoạt chất kháng nấm cao TK phổ khối, 1H NMR 13C NMR Tác động kháng Candida albicans cao Trầu không hoạt chất kháng nấm xác đinh phương pháp pha loãng theo hướng dẫn CLSI M27-A2 Môi trường sử dụng: Mueller Hinton broth bổ sung xanh methylen glucose KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Phân lập hoạt chất kháng nấm cao TK Phân lập hoạt chất kháng nấm cao TK Sau cao TK (0,6 g) triển khai qua cột Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 thu 10 phân đoạn, có PĐ dạng dầu, màu vàng xanh (206,7 mg) PĐ 2, tinh thể trắng xám, dễ chảy lỏng, Rf = 0,54, chiếm 307,4 mg cho tác động kháng C albicans với đường kính vòng kháng nấm 28 mm, phân đoạn lại khơng cho tác động kháng nấm Sắc ký đồ phân đoạn sắc ký lớp mỏng tinh phân đoạn nên sử dụng nghiên cứu Nghiên cứu Y học Kiểm tra phân đoạn chứa hoạt chất kháng nấm (PĐ 2) sắc ký lớp mỏng kỹ thuật hình sinh học Kết hình cho thấy phân đoạn chứa hoạt chất kháng nấm cho vết sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng (SKLM) chiều (Rf = 0,54) hai chiều Vết cho vòng kháng nấm kỹ thuật hình sinh học VK 1 2 A Hình 1: Phân đoạn chứa chất kháng nấm cho sắc ký đồ SKLM cho vòng kháng nấm xác định kỹ thuật hình sinh học B Hình 2: Sắc ký đồ sắc ký chiều hoạt chất chiết từ cao TK (A: Phát vết UV 254 nm; B: Phát thuốc thử VS) Kiểm tra hợp chất kháng nấm UV – vis sắc ký khí Kết hình cho thấy sắc ký đồ GC hợp chất kháng nấm cao TK cho đỉnh có thời gian lưu 35,56 phổ UV – Vis chất có đỉnh hấp thu 282 nm Hình 4: Phổ UV –Vis hợp chất kháng nấm Xác định MIC hợp chất phân lập từ cao TK Hình 3: Sắc ký đồ GC hợp chất kháng nấm Từ kết sắc ký lớp mỏng chiều, chiều, kỹ thuật hình sinh học, phổ UV-Vis, sắc ký khí MIC cho thấy hợp chất có phân đoạn phân tách từ cao TK chứa chất, chất hoạt chất cho tác động kháng nấm có Trầu khơng Bảng 1: Nồng độ MIC chất kháng nấm cao TK Chuyên Đề Dược Học 237 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học STT Độ dịch chuyển Dạng Hằng số Số Vị trí hóa học (ppm) đỉnh ghép (Hz) proton proton 5,041-5,007 D H-3’ C albicans Chất thử Cao TK Chất kháng nấm cao TK MIC (mg/ ml) 0,512 0,256 Xác định cáu trúc hóa học hoạt chất kháng nấm cao TK Bảng 2: Dịch chuyển hóa học phổ 1H NMR chất kháng nấm có cao TK 5,004-4,996 D 3,178-3,164 D 8,595 S 6,647-6,631 6,561-6,557 6,426-6,406 5,924-5,843 D ds dd M 8Hz 2Hz 2Hz, 8Hz OH 1 1 H-6 H-3 H-5 H-2’ H-3’ H-1’ Bảng 3: Dịch chuyển hóa học phổ 13C NMR chất kháng nấm có cao TK STT STT Độ dịch chuyển Dạng Hằng số Số Vị trí hóa học (ppm) đỉnh ghép (Hz) proton proton 8,705S OH 7Hz Độ dịch chuyển hóa học (ppm) 145,076 143,390 138,292 130,432 118,993 115,810 115,475 115,033 38,910 Vị trí C C-2 C-1 C-2’ C-4 C-5 C-6 C-3 C-3’ C-1’ 3' 2' 1' OH OH Hình Phổ khối hợp chất kháng nấm cao TK 2-hydroxy chavicol Các kết thu ứng dụng Qua phân lập xác định hoạt chất kháng kiểm nghiệm nguyên liệu sản phẩm nấm có cao TK, liệu phổ khối (hình chiết xuất từ Trầu không 5), 1H NMR 13C NMR hoạt chất kháng nấm cao TK, với độ dịch chuyển hóa học bảng bảng 3, cho thấy cấu trúc hóa học chất kháng nấm cao TK phù hợp với cấu trúc 2-hydroxychavicol với công thức nguyên C9H10O2, MW 150 (7) Kết phù hợp với nghiên cứu trước hoạt chất cho tác động kháng nấm – kháng khuẩn có cao chiết từ Trầu không số nước Châu Á Ấn Độ (2), Mã lai (4), … KẾT LUẬN Lá trầu không sử dụng nhiều y học cổ truyền Việt Nam từ xưa đến chưa nghiên cứu cách có hệ thống 238 TÀI LIỆU THAM KHẢO Hemamalini V, Dass Prakash MV, Sivaramakrishnan1 S (2012), “Evaluation of the In vitro antioxidant, AntiEnteropathogenic and Anticancer Efficacy of Natural and Synthetic Hydroxychavicol”, Int J Med Res.,1(5): 250-254 Kushagra N et al (2011), “Piper betle L.: A review on its ethnobotany, phytochemistry, pharmacological profile and profiling by new hyphenated technique DART-MS (Direct Analysis in Real Time Mass Spectrometry)”, Journal of Pharmacy Research, 4(9): 2991-2997 Nguyễn Đinh Nga, Nguyễn Văn Thanh (2010), “Thành phần tác động kháng Candida spp tinh dầu cao chiết từ Trầu khơng Việt Nam”, Tạp chí Dược Học, 410: 27-30 Nalina T and Rahim ZHA, (2007), “The Crude Aqueous Extract of Piper betle L and its Antibacterial Effect Towards Streptococcus mutans”, American Journal of Biotechnology and Biochemistry (1): 10-15 Rahul S et al (2009), “Antibacterial Activity of Fresh leaves of Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Piper betle Linn”, The Pharma Research, 01: 110-113 Tạ Thu Thủy, Nguyễn Văn Toại (2011), “Đánh giá tác dụng giảm đau phác đồ BETELVINE (TRẦU KHÔNG) + SUCRATEGEL (BS) điều trị chứng viêm dày mạn tính nhiễm HP (vị quản thống)”, Y học thực hành, 7(774): 159 Properties of Hydroxy chavicol, http://chemeo.com/cid/33057-2 Chuyên Đề Dược Học Ngày nhận báo: Nghiên cứu Y học 11.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo: 22.12.2013 Ngày báo đăng: 10.03.2014 239 ... cho thấy hợp chất có phân đoạn phân tách từ cao TK chứa chất, chất hoạt chất cho tác động kháng nấm có Trầu không Bảng 1: Nồng độ MIC chất kháng nấm cao TK Chuyên Đề Dược Học 237 Y Học TP Hồ Chí... (4:6)); sắc ký khí phổ UV-Vis Xác định cấu trúc hoạt chất kháng nấm cao TK phổ khối, 1H NMR 13C NMR Tác động kháng Candida albicans cao Trầu không hoạt chất kháng nấm xác đinh phương pháp pha loãng... methylen glucose KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Phân lập hoạt chất kháng nấm cao TK Phân lập hoạt chất kháng nấm cao TK Sau cao TK (0,6 g) triển khai qua cột Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập